急性脑卒中患者血清PTX3、miR-199a的水平变化及临床意义

张 芹，张淑青，王新昌，何 楠，魏丹丹，杨科朋

急性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，可分为出血性卒中和缺血性卒中，其中缺血性卒中更为常见，约占80%[1]。急性脑卒中具有起病急、病情进展快、致残率高、致死率高等特点，可对患者的生活质量以及生命健康构成巨大的威胁[2]。由于急性脑卒中治疗时间窗较短，因此快速、正确地分型诊断超早期脑卒中具有非常重要的临床意义，其对患者的治疗与转归均有直接的影响，除病史和体格检查、影像学检查外，实验室检查在超早期脑卒中的诊断、分型中也有重要的作用[3]。正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)是一种参与了机体炎症反应的细胞因子，且其在动脉粥样硬化的形成和发展中均起到了重要的作用[4]。miR-199a是一种与新生血管形成密切相关的微小RNA，过往的研究多为其与恶性肿瘤相关的内容，然而近年来的研究发现[5]，miR-199a在脑血管疾病的发生、发展中也发挥了一定的作用。本研究旨在探讨急性脑卒中患者血清PTX3、miR-199a的表达情况，并进一步分析了二者与患者神经功能的关系及其对疾病的辅助诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月到2019年12月期间在我院接受治疗的急性脑卒中患者83例作为研究组，纳入标准：(1)均为急性缺血性脑卒中，诊断标准参考《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[6]；(2)发病至入院时间<6 h；(3)临床资料完整；(4)患者家属对本次研究知情同意，并签署了知情同意书。排除标准：(1)有颅内出血者；(2)合并恶性肿瘤者；(3)脑卒中复发病例；(4)合并慢性炎症性疾病或者近期有严重感染性疾病；(5)存在严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；(6)近期有大型外科手术史者。83例患者中男性53例，女性30例，年龄48～74岁，平均年龄(59.63±5.94)岁，合并基础疾病：高血压52例，糖尿病19例，高脂血症15例，吸烟史35例。质量指数17.52～24.83 kg/m2，平均体质量指数(21.62±2.48)kg/m2。另选取同期在我院进行体检的志愿者40例作为对照组，其中男性26例，女性14例，年龄43～73岁，平均年龄(58.49±6.24)岁，合并基础疾病：高血压18例，糖尿病8例，高脂血症7例，吸烟史14例。质量指数17.85～25.42kg/m2，平均体质量指数(21.94±2.56)kg/m2。两组研究对象的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本次研究已获得了我院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 神经功能评估 采用美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)评估患者的神经功能[7]，该得分越高代表病情越严重。根据NIHSS评分对研究组患者进行再次分组，其中≤4分纳入到轻度组(26例)，5～15分纳入到中度组(30例)，≧16分纳入到重度组(27例)。

1.2.2 血清学指标检测 抽取所有研究对象的静脉血5 ml，以3000 r/min的转速离心10min，提取血清，采用双抗夹心酶联免疫吸附法检测血清PTX3、中枢神经特异蛋白(Soluble protein-100β，S100-β)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)的水平。相关试剂盒购于南京建成生物工程研究所，相关检测均严格遵循对应试剂盒的操作指南进行。采用实时荧光定量PCR法检测血清中miR-199a的相对表达量，Trizol 试剂盒(Fcrmenas 公司)提取血清中的总RNA，逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取cDNA，以U6为内参基因，引物系列如下，U6正向引物：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，反向引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’，miR-199a正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。反应条件：95℃预热30 s，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s，共40个循环。采用2-Ct法计算血清中miR-199a的相对表达量。

2 结 果

2.1 两组研究对象的相关指标比较 研究组患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平高于对照组，血清miR-199a水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，如表1所示。

表1 两组研究对象的相关指标比较

2.2 不同神经功能患者的相关指标比较 三组患者的血清PTX3、miR-199a、S100-β、NSE水平以及NIHSS评分整体比较差异有统计学意义(P<0.05)，重度组患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS评分高于中度组和轻度组，血清miR-199a水平低于中度组和轻度组(P<0.05)，中度组患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS评分高于轻度组，血清miR-199a水平低于轻度组(P<0.05)(见表2)。

表2 不同神经功能患者的相关指标比较

2.3 血清PTX3、miR-199a与神经功能的关系 经Pearson分析显示，急性脑卒中患者血清PTX3与S100-β、NSE、NIHSS评分均呈正相关(r=0.321、0.358、0.372，P<0.05)，血清miR-199a与S100-β、NSE、NIHSS评分均呈负相关(r=-0.393、-0.412、-0.405，P<0.05)。

2.4 血清PTX3、miR-199a对急性脑卒中的诊断价值分析 ROC分析显示(见图1)，血清PTX3、miR-199a对急性脑卒中均有一定的诊断价值，PTX3和miR-199a的曲线下面积分别为0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，二者联合诊断时两者均为阳性结果为阳性，否则为阴性，结果显示二者联合可进一步提高对急性脑卒中的诊断价值，具体数据见表3。

表3 血清PTX3、miR-199a对急性脑卒中的诊断价值分析

图1 血清PTX3、miR-199a对急性脑卒中的诊断价值分析(A：PTX3；B：miR-199a)

3 讨 论

脑部血液供应障碍是急性缺血性脑卒中的重要发病原因，脑部组织缺血后会出现缺血、缺氧性损伤，严重时可导致部分脑组织坏死，出现相应的神经功能障碍。急性脑卒中是世界第二、中国首位的死亡原因，患者在发病3 m时病死率为9%～9.6%，而致残率为34.5%～37.1%，严重威胁中老年人群的生命健康[8]。据统计[9]，我国近20年来急性脑卒中的死亡率并没有下降，而且随着老年化社会的到来，其患病率和发病率已呈增高趋势，如何有效的防治急性脑卒中已成为我国重要的公共卫生问题。

动脉粥样硬化是导致斑块破裂性血栓形成的病理基础，其为各种缺血性心脑血管疾病的重要病理改变。PTX3是一种与动脉粥样硬化密切相关的蛋白，位于人第3号染色体q25，其可有效促进机体的炎症反应，参与了急性脑卒中的发生、发展[10]。近年研究发现，微小RNA在缺血性脑卒中的病理生理机制中扮演着重要的角色，急性脑卒中患者的微小RNA表达谱有明显变化，且这些异常表达的微小RNA通常与机体的炎症、免疫反应、内皮功能损伤等有关[11]。miR-199a是近年来发现的与心脑血管疾病密切相关的微小RNA，其可介导机体的炎症反应，参与了动脉粥样硬化的形成[12]。本研究结果显示，研究组患者的血清PTX3水平高于对照组，血清miR-199a水平低于对照组，且随着神经功能损害加深，患者的血清PTX3水平逐渐升高，而血清miR-199a水平则逐渐降低，由此可见PTX3、miR-199a在急性脑卒中患者血清中呈异常表达，且其表达水平与患者的神经功能损伤情况有关。PTX3是一种炎症相关因子，其不但可以促进机体的炎症反应，同时其表达水平也与机体的炎症反应程度存在正反馈调节的关系，血管平滑肌细胞、内皮细胞在肿瘤坏死因子-ɑ、白介素-6等促炎因子的刺激下会增加PTX3的分泌[13]，进而导致急性脑卒中的血清PTX3水平上升。miR-199a与急性脑卒中的研究尚处于初级阶段，其在患者血清中表达降低可能与血流剪切力大小有关，相关研究显示[14]，血管内皮细胞在受到高剪切力后miR-199a的表达下降，而在受到低剪切力时其表达会明显上调[15]。血栓的存在会导致血管壁的压力和壁面剪切力上升，因此在急性脑卒中患者血栓形成的血管壁附近存在较高的血流剪切力，进而会导致血管内皮细胞中的miR-199a的表达下降，这可能是急性脑卒中患者血清miR-199a低表达的原因之一。此外，本研究结果还显示，急性脑卒中患者血清PTX3与S100-β、NSE、NIHSS评分均呈正相关，血清miR-199a与S100-β、NSE、NIHSS评分均呈负相关，这进一步说明PTX3、miR-199a的表达水平与患者的神经功能有关。PTX3可通过促进平滑肌细胞迁移和增殖、上调组织因子的表达导致机体处于高凝状态等方面来增加血栓形成的风险，并且在出现急性脑卒中后还可以通过促进炎症反应加重患者的病情，增加患者的神经功能损伤程度[16，17]。miR-199a亦是一种炎症相关因子，曾庆坛等[18]的研究显示，动脉粥样硬化的斑块内miR-199a可有效抑制单核细胞炎性反应，还有相关研究显示[19]，miR-199a下降可导致血管内皮功能障碍，因此miR-199a可能是通过调节炎症反应和内皮功能来影响患者的病情，进而影响患者的神经功能。在诊断价值方面，ROC分析显示，血清PTX3、miR-199a诊断急性脑卒中时的曲线下面积分别为0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，可见二者对疾病均有一定辅助诊断价值。然而两指标的特异性均较低，故在联合诊断时采用了串联实验，结果显示，二者联合可进一步提高对急性脑卒中的诊断价值。

综上所述，急性脑卒中患者血清PTX3呈高表达，miR-199a呈低表达，且二者的表达均与患者的神经功能密切相关，二者对疾病均有一定辅助诊断价值。由于研究时间所限，仅有少量患者得到了长时间的随访，大部分患者的随访资料还在统计中，因此并未分析两指标与患者预后的关系，这一部分研究将在后续完成。