中国人群原发性不宁腿综合征新风险基因的相关性研究

黄 雷，陈 捷，黄豫萌，王 佩，马建芳

不宁腿综合征(Restless legs syndrome/William-Ekbom disease，RLS/WED)是一种神经系统疾病，其特征是患者出现想要活动双腿的强烈冲动，伴或不伴有腿部感觉不适[1，2]。这种症状主要出现在平卧或静坐等休息状态，主要在夜间出现或夜间症状更明显，持续行走可以缓解，可导致失眠影响患者生活质量[3]。研究表明欧洲和北美的成年人群的RLS/WED患病率为1.9%～4.6%[4]，然而亚洲国家RLS/WED 患病率显著下降(约0.1%～3.9%)[5～9]。此外，RLS/WED 症状更易出现在铁缺乏、肾功能不全、心血管疾病、糖尿病或偏头痛人群中[10]。目前多巴胺能药物是最有效的治疗药物，但长期服用多巴胺能药物可能导致严重的副反应，如症状加重现象[11]。

RLS/WED 是一种复杂的疾病，环境和遗传因素都可影响其表型，但其发病机制目前仍未明确，遗传学研究为潜在发病机制提供了线索[12]。迄今为止，全基因组测序(Genome-Wide Association Study，GWAS)已经发现了6个风险基因点与不宁腿综合征相关，包括MEIS1、BTBD9、PTPRD、MAP2K5/SKOR1、TOX3和Intergenic region of 2p14[13～16]。近期，一个纳入了3个全基因组相关性研究的荟萃分析证实了之前报道的6个风险基因并发现了13个新的风险基因[17]。我们的团队之前报道过中国人群中BTBD9和MAP2K5/SKOR1与RLS/WED 的联系[18]。本次研究，我们选取了荟萃分析中发现的19个风险基因中的20个主要SNPs，研究其在中国人群中是否与RLS/WED 发病风险相关。

1 资料与方法

1.1 资料 研究人群：所有RLS/WED 患者均在门诊招募，临床症状符合国际不安腿综合征研究组(International RLS study Group Rating Scale，IRLSSG)的诊断标准[3]，排除了继发性RLS/WED，包括继发于帕金森病、周围神经病、肾功能不全、缺铁、妊娠、肌痛和静脉血粘滞等。缺铁的判断标准为血清铁蛋白<30 ng/ml。IRLSSG 评分量表用于评估RLS/WED 的严重程度[19]。我们同时收集了RLS/WED 患者的家族史。对照人群是在社区招募，拥有相同种族背景的人群，所有人都接受了完整的神经系统检查，排除了系统性疾病，震颤和其他运动障碍，并通过了RLS/WED 排除标准的评估且没有 RLS/WED 家族史。该研究得到上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会的批准。所有参与者均签署了知情同意书。

1.2 方法 DNA制备和基因分型：从患者组和对照组中每人收集2ml血液，采用苯酚-氯仿-异丙醇法提取DNA[20]。我们选择了Schormair等的荟萃分析中报道的具有显著性的20个主要单核苷酸多态性(包括rs12046503，rs10208712，rs113851554，rs1820989，rs80319144，rs1848460，rs35987657，rs17636328，rs61192259，rs10952927，rs1836229，rs62535767，rs340561，rs996064，rs111652004，rs868036，rs45544231，rs12450895，rs12962305，rs365032)[17]。其中的7个SNPs(rs12046503，rs1848460，rs61192259，rs10952927，rs62535767，rs340561，rs12450895)采用了Sanger 测序法进行基因分型。其他13个SNPs采用SNaPshot多重单碱基延伸SNP分型技术(Multiplex SNaPshot)进行基因分型。PCR产物采用磷酸化酶(FastAP)和核酸外切酶I(EXO I)纯化，用ABI SNaPshot 多重分析试剂盒延长。延长产物采用磷酸化酶(FastAP)纯化并负载至ABI3730xl。SNP的基因分型使用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)进行分析。

统计分析：使用SAS(9.4 TS1 M2版本；SAS Institute Inc，Cary，NC)软件包进行统计分析。Wilcoxon 秩和检验用于比较RLS/WED患者和非RLS/WED对照之间的年龄差异。卡方检验用来比较组与组之间的性别构成比以及在总研究人群中的哈-温平衡，所有SNPs 的等位基因频率也通过卡方检验进行比较。我们评估了经性别和年龄矫正后的显性模型，隐性模型和加性模型。采用logistic回归进行基因型关联分析，计算出每个SNP的比值比(odds ratio，OR)和95%的置信区间(confidence intervals，CI)。R语言(版本3.3.1)用于通过Bonferroni方法校正P值。运用Power and Sample Size Calculations(version 3.1.2)来计算检验效能[21，22]。遗传功效是基于本研究中患者和对照人群的实际等位基因频率。

2 结 果

本次研究总共纳入了184例原发性RLS/WED患者和230例健康对照。人口学资料显示，RLS/WED患者与对照组之间在年龄和性别上无统计学差异。31.6%的患者有RLS/WED家族史。在RLS/WED患者组，IRLSSG评分量表的平均分为(20.42±4.71)，平均铁蛋白水平为(140.76±84.20) ng/ml(见表1)。

表1 病例和对照的人口统计信息

在检测的20个SNPs中，有3个对照组的SNPs(rs1836229，rs996064，rs12450895)不符合哈迪-温伯格平衡，2个SNPs(rs10208712，rs113851554)未见基因的多态变化。因此只有15个SNPs被纳入最终的数据分析。所有的SNPs漏检率都小于3.5%。研究中我们发现RLS/WED患者的rs365032等位基因G出现频率高于对照组(OR=1.36，P=0.032)(见表2)。在经年龄和性别矫正后的显性模型中，rs365032的基因型GG型和GA型相对于AA型(显性模型)在RLS/WED患者中较高(OR=1.77，P=0.009)(见表3)。但是经Bonferroni 方法矫正后所有的差异均无统计学意义。其他SNPs的基因型或等位基因突变频率也未发现有显著差异。

表2 20个SNPs位点与RLS风险关联分析

表3 年龄性别矫正后20个SNPs位点与RLS风险关联分析

另外，为了确定这20个与RLS/WED相关的SNPs是否与性别有关，我们根据性别做了进一步的亚组分析。在女性组，RLS/WED患者的rs868036的等位基因T频率高于对照组(OR=1.56，P=0.021)。在男性组，经过年龄矫正的加性模型显示rs10952927存在等位基因剂量效应(OR=1.65，P=0.036)。但是Bonferroni 矫正后所有差异无统计学意义。

3 讨 论

这是首次在中国RLS/WED人群中重复GWASs荟萃分析[17]发现的20个独立关联信号的研究。在中国人群中，我们没有发现SNPs的基因型或等位基因突变频率在RLS/WED患者和健康对照之间有明显差异。

本研究中，我们发现rs365032的多态性与RLS/WED的发病风险相关，此外rs868036和 rs10952927的多态性分别在女性分组和男性分组显示出与RLS/WED的相关性，尽管所有显示的差异经Bonferroni矫正后无统计学意义。rs365032是MYT1上游的突变，MYT1在中枢和外周神经系统均有表达，有促进神经细胞分化的功能[23]。rs868036位于MAP2K5的内含子中，有趣的是，这个基因曾被报道与中国人群RLS/WED发病风险相关[18]。SNP rs10952927位于ZNF804B和ADAM22附近的风险基因，这两个基因都与神经退行性疾病的发病机制相关[24，25]。但是，因为这3种SNPs的差异经多次矫正后无显著性，以上的发现只是一些推测，还需大样本或基础研究来证实。

和本研究相似的是，在Guy等的研究[26]中，他们综合了7个法国-加拿大大家族的全外显子序列来探究位于19个风险位点内小于1Mb的基因上的可能导致蛋白质改变的潜在致病突变。但他们没有发现任何与RLS/WED风险相关的非同义突变。他们研究的家族出现RLS/WED可能是由于19个风险位点的非编码调节区域出现了突变或者存在尚未发现的风险位点。

我们的研究存在一定的局限性。首先，病例组和对照组的样本量小，降低了研究的说服力，且可能导致由膨胀效应引起的假阴性。第二，因为资金限制，我们只检测了GWASs荟萃分析中报道的风险基因的主要SNPs。这些风险基因可能还有其他的具有显著性的突变，而不同的人种中相同危险基因的SNP也并不相同，这需要通过进一步大样本的全基因组测序来确定。第三，我们采用自我报告的形式判断种族背景而不是进行遗传学祖源检验，这使得我们研究的人群中可能存在种族背景的亚组。总之，我们的研究并没有在中国人群中复制出19个风险基因的主要SNPs与RLS/WED发病风险的联系。种族的异质性和样本量小可能是我们的研究结果不同于GWASs荟萃分析结果的原因。未来还需要大规模的全外显子测序，甚至全基因组测序来探索中国人群的19个风险基因的潜在致病突变。