人布氏杆菌病实验室诊断技术及治疗*

刘 丹 赵世刚 赵婷婷

内蒙古医科大学附属医院，内蒙古呼和浩特市 010000

近年来，我国布氏杆菌病有向非牧区扩散的趋势，受疾病影响地区已扩展到南部沿海和西南地区，布氏杆菌病疫情防控形势严峻[1]。布氏杆菌侵入人体后随血流到达全身各个部位，使布氏杆菌病的临床表现因其受累部位及病程长短不同而表现不一且缺乏特异性，随着解热镇痛药及抗生素的广泛应用，原本典型的“波状热”不易显现，加之有时患者处于疾病初期，症状轻微而被本人忽视，疾病的转归往往不理想。

1 实验室检查技术进展

由于布氏杆菌病的临床表现复杂多样，快速、准确、易行的实验室检测方法对于早期诊断该病来说至关重要。目前诊断布氏杆菌病的方法虽多，却往往存在着灵敏度低、特异性差、费时费力、甚至潜在的生物风险等缺陷。

1.1 细菌培养 从患者血液及其他受感染组织中分离培养出该菌判为培养阳性，是诊断此病的金标准。血液较易获得且阳性率较其他组织成分高，因此血培养是检测此病较常用、较理想的方法。但是，布氏杆菌的生长速度慢、培养操作要求高且风险较高，易受疾病阶段及就诊前抗生素使用的影响，导致培养结果阳性率低，分离鉴定存在较大难度，容易漏诊及误诊。

1.2 血象变化 国外有研究表明[2]，布鲁氏菌病患者的血象相对特异，为CRP显著升高，白细胞计数增加，血小板及淋巴细胞计数减少，这可用于布氏杆菌感染人类的初步诊断和评估。

1.3 血清学检测 与培养方法比较，血清学试验快速、无危害、更敏感，在常规的临床实验室更容易操作。

1.3.1 特异性凝集试验：包括平板凝集试验(PAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)及试管凝集试验(SAT)。临床上常使用PAT、RBPT进行大面积筛查，之后用SAT进行复核及定量检测，这被用作我国布氏杆菌病的确诊试验。上述凝集试验均存在交叉反应而出现假阳性结果。

1.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)：许多研究都得出ELISA特异性优于试管凝集试验的结论。但该试验所需试剂盒价格较贵，抗体保存时间及条件严格，操作过程用时较长，适用于科研而不适宜用作该病的筛查方法。

1.3.3 其他血清学实验：(1)补体结合实验(CFT)：补体结合的目标是抗原抗体复合物，有研究使用完整的布氏杆菌菌体或其提取物为抗原、以豚鼠血清为补体进行该实验，间接测定患者血清中抗布氏杆菌抗体，得出特异性较好、灵敏度较差的结论。由于其具有高度特异性，是目前血清学试验中最为准确的技术之一，且国际有统一的判定标准，可用作该病的确诊实验之一[3]。缺点是操作技术复杂，相对耗时。(2)免疫胶体金技术(GICA)：胶体金能快、准、稳地与目标蛋白结合而不改变其生物性状，可利用该技术用胶体金标记 proteinA以间接检测血清中的抗布氏杆菌抗体，这种技术的特异度及灵敏度均较高，且操作简便，能快速得出结果，适宜于在基层单位开展应用[3]。(3)免疫捕获凝集技术(BICA)：是检测所有针对布氏杆菌的免疫球蛋白的一种方法。BICA可以帮助发现患病病程较长的患者，故可以用来区分急性和慢性感染，而这是使用SAT无法辨别的。在治愈的患者中，包括BICA在内的很多检测方法在疾病治愈后可能会长时间持续保持阳性，但相比于其他检测方法，BICA在治愈后患者的特异性抗体滴度下降比其他检测方法更快。鉴于BICA特异性较高，而i-ELISA的灵敏度很高，可考虑与ELISA联合使用起到互补作用[4]。(4)超灵敏双色布氏杆菌测定(LFIA)：是一种侧向流免疫测定法,朱明松等制备了榴梿样金纳米颗粒(GND)，并用葡萄球菌蛋白A标记，用来检测布氏杆菌抗体，观察到诊断灵敏度和特异性为100%。无须样品预处理或血液过滤垫即可检测血清、血浆甚至全血中的抗体，再加上其100%的灵敏度及特异度，可用于布氏杆菌病的早期诊断[5]。(5)免疫荧光染色(IFS)：是检测外周血单个核细胞中布鲁氏菌抗原的灵敏方法，杨恒等人的研究认为IFS可在临床实践中用于布鲁氏菌病的诊断和治疗监测[6]。(6)布氏杆菌凝胶试验(BCGT)：STA和BICA至少需要18～24h的培养时间，而BCGT不需要太多时间，也不需要太多的预处理，在2h内即可得到结果。BCGT的敏感性和特异性都相对较好，可用作布氏杆菌病的筛查及早期诊断[7]。(7)免疫磁珠技术：李莉等人新开发的一种基于免疫磁珠(IMB)探针和量子点(QDs)——葡萄球菌蛋白a(SPA)探针的快速、灵敏、准确的布氏杆菌病诊断方法。该方法诊断灵敏度为96.15%(95%CI，91.82%～98.58%)，特异性为94.12%(95%CI，87.64%～97.81%)，荧光强度截止值为150.4，检测时间仅为100min，可应用于布氏杆菌病的诊断。该方法检测时间仅为100min，包括富集时间和标记时间，相比于i-ELISA包括血清反应时间、二次抗体反应时间和显色时间的160min检测时间，这种方法更高效[8]。(8) Coombs Wright：与大多数感染性疾病相比，布氏杆菌病的IgM反应在急性期后仍然存在，IgG反应在改善后往往会减弱，IgG抗体没有终身阳性。2-ME：仅测量IgG抗体。IgG的降低比IgM的水平更好，表明治疗成功。据报道，IgG水平的快速下降是反应治疗成功的指标。在慢性布鲁氏菌病中，凝集素IgG被非凝集素IgG代替，这只能通过Coombs Wright进行测量。在急性病例中，STA和Coombs Wright检验一定同时具有不同的滴度(由于存在凝集素和非凝集素抗体； Coombs Wright阴性和STA阳性)，而在慢性布鲁氏菌病中，通常期望相同的滴度(两种检验均为阳性)。因此，如果个体中仅存在IgM抗体，相同滴度的Wright和Coombs且2-ME试验阳性可能会导致误诊和过度治疗[9]。

1.4 分子生物学技术 大量的临床试验发现，传统 PCR 技术具有高灵敏度，多重PCR具有高特异度，Real-time PCR 技术同时具备前两者的优点，且检测时间不足2h，重现性较好，易于标准化，临床上多使用该技术作为疗效的监测及评估。虽然进行PCR检测的时间不长，但前期需在患者的血液中提取布氏杆菌的DNA，这个过程需要至少48～72h，这限制了PCR在布氏杆菌病诊断中的应用[10]。

2 治疗现状

治疗原则为早期、规范、足量、联合，目的是缓解患者急性期症状，预防疾病转为慢性、反复发作。

2.1 传统治疗

2.1.1 主要用药方案：(1)急性期治疗：①对症支持治疗：布氏杆菌病属于消耗性疾病，病程中除对症处理外需卧床静养，保证日常所需足够的能量摄取。②病原学治疗：根据临床已有的治疗经验来看，单一用药治疗该病易复发，目前公认联合应用2～3种抗生素：四环素类+利福平+氨基糖苷类/磺胺类/头孢类/喹诺酮类，治疗效果肯定，四环素类药物廉价、易购、副作用小；利福霉素类药物的副作用较大，治疗疗程根据病情需要，最短6周，最长可规律用药半年以上甚至更长。(2)慢性及亚急性布氏杆菌病的治疗：①菌苗疗法：即脱敏疗法。近期治疗显效率明显优于远期，可达70%以上。因其副作用大，所以患有心、肝、肾等脏器基础疾病及孕妇禁用。②抗菌治疗：同急性期，必要时重复多个疗程。国外研究表明，疗程不足5个月者复发率较高，对于有效治疗并发症及预防复发，三联用药为佳。(3)并发症的治疗：为将已产生的并发症造成的损害降到最低，在三联使用抗生素的基础上根据病情需要采用理疗、针灸、手术等治疗方法。

2.1.2 传统疗法上的新观点： 虽然调查研究[11]发现，最常使用的治疗方案仍是多西环素+利福平，但是国内外很多研究[12]目前支持在三药联合治疗中，多西环素为必须用药，可搭配另外两种非利福霉素类抗生素或者一种非利福霉素类抗生素+一种中药制剂(如复方甘草酸苷)，这种联合用药均疗效肯定，不易复发。这个发现有利于克服利福霉素类长期应用带来的副作用及有些抗生素易产生耐药性的短板，这需要更多的临床试验、观察来验证。复杂病例中建议三药联用，而对于短期治疗，两种药物联合应用或许见效更快，依据病情适当延长疗程可有效减少复发。

2.2 中西医结合、蒙医西医结合 主要应用抗生素的西医疗法结合中医、蒙医等领域的药物或其特色疗法对慢性布氏杆菌病及产生并发症的患者进行治疗。在急性期，中西医联合用药可明显减轻机体炎性反应，缓解病情；慢性期，在抗生素治疗的基础上，联合使用小柴胡汤等中药方剂可有效降低复发率；出现并发症时，予拔罐、针灸等中医特色治疗亦疗效显著。

2.3 其他有效药物探索

2.3.1 胸腺五肽[13]：能增强巨噬细胞清除病原体的作用，帮助抗生素清除定植在细胞内的布氏杆菌。在常规抗生素治疗的基础上可加用胸腺五肽等免疫调节剂作为治疗慢性布氏杆菌病的辅助用药。

2.3.2 牛磺去氧胆酸药物：Coronas-Serna等的研究[14]发现，通过牛磺去氧胆酸药物对UPR的破坏可以抑制布氏杆菌的繁殖。该药可以成为布氏杆菌病的一个新型靶向药物。

2.3.3 人参皂苷A(RGSF-A)[12]：它通过参与MAPKs(促分裂原激活的蛋白激酶)的下调，限制了F-肌动蛋白的聚合并抑制布氏杆菌渗透到细胞中。LAMP-1是跨膜蛋白，负责溶酶体与吞噬体的融合，使BCP与溶酶体连接并消除细菌，RGSF-A通过促进布氏杆菌LAMP-1的含吞噬体(BCP)的相互作用，影响布氏杆菌的胞内运输。Huy TX等人的研究[15]已证明RGSF-A的人参皂苷Rg3-人参二醇皂苷成分已成为控制布氏杆菌病的主要因素，将其作为主要成分制成药物将对布氏杆菌病的治疗提供更多的选择。

2.3.4 利福布汀：实际上是一种利福平衍生物药物，能像利福平一样阻断RNA聚合酶的酶，此外还能减少与其他药物的相互作用。Oguz Karabay的临床资料[16]发现利福布汀、氧氟沙星和头孢曲松联合用药成功用于1例对多种治疗布氏杆菌病的常用药物耐受患者的治疗，该药可作为利福平等常用药物耐受的替代用药。

3 小结与展望

如前所述，布氏杆菌病目前防控形势严峻。医务人员尤其是非疫区的医务人员应当重视起来，病史采集中注意询问牛羊接触史等可有效减少漏诊。目前人类被感染的影响因素有：直接接触患病动物(包括牲畜、宠物及观赏性动物)、食用动物源性污染的食品、实验研发生产等职业暴露[17]。职业相关人员做好个人防护及普通人群不食用半熟或不熟动物源性食物是重要的预防措施。另外，建立一套针对布氏杆菌病的快速、准确、灵敏、易行、省时的检测方法是重中之重，以便用于疾病的早期诊断。本文已列举了目前布氏杆菌病现有实验室检测方法，传统方法具有灵敏度、特异度低及操作复杂、耗时等缺点，新研究的几种方法灵敏度及特异性较高但缺乏大量临床验证。一方面，应当继续探索新的诊断技术，另一方面，也应当同时进行大量的临床试验来选定高效确诊的一套检验方法最佳组合。就该病的治疗来讲，2～3种抗生素的联合使用是公认有效的治疗方法，但抗生素类药物存在易产生耐药性及副作用大等缺点，新型药物的研制为患者带来了福音，如何选用药物、所产生的治疗效果如何最大化都需要大量临床试验来验证。中医、蒙医及其他少数民族特有的医术，能流传至今都有其发光点，与西医结合共同治疗布氏杆菌病及其并发症是治疗方面新的思路，在治疗中因地制宜的融入其中将取得不错的疗效。