黑枸杞花青素通过Ⅲ-PI3K通路调控小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬

武 强，薛才华，王梦杰，刘嘉华，张龙飞，吴 华

(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)

黑枸杞又被称为“甘枸杞”，茄科枸杞属中的植物，属于类黄酮化合物，是一种滋补药材，被称为“滋补软黄金”。是我国西北部盐化沙地、沼泽、荒漠地区所特有的生命力顽强的药用植物。黑枸杞中主要含有氨基酸、多酚、不饱和脂肪酸、多糖、花青素、维生素E以及各种微量元素，有着极高的营养价值和药用价值[1-2]。花青素是一种黄酮类的水溶性色素，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑菌、等多种药理作用[3]。细胞自噬(Autophagy)是真核生物进行自我保护的一种机制，主要是通过溶酶体对细胞内的蛋白质和细胞器进行融合降解从而达到细胞稳态[4]。真核生物的大部分细胞在正常生理状态下自噬会保持较低的水平，称之为基础自噬；当营养物质或能量缺乏、受到病毒，微生物等病原体刺激时，细胞的自噬水平会发生较大的提升，称为诱导性自噬[5]。目前，越来越多的研究表明，细胞自噬与机体的免疫系统存在很大的联系，其与病原的清除、炎症反应以及抗原呈递存在紧密联系[6-7]。

黑枸杞花青素具有多种生理功能，但基于细胞自噬揭示免疫功能的研究较少。巨噬细胞是机体免疫系统功能中重要的组成部分，其主要功能是参与抗原处理、消灭各种病原微生物、抗肿瘤作用等。巨噬细胞与自噬有着密不可分的联系，巨噬细胞可通过其对入侵细胞的内吞作用形成自噬体结构，再与溶酶体融合形成成熟的吞噬溶酶体，以有效杀伤清除细菌[8]。基于此，本文拟探究黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞Raw264.7自噬的调节作用，为深入研究黑枸杞花青素对细胞水平的免疫功能机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小鼠巨噬细胞株RAW264.7，购买于中国科学院上海细胞库；黑枸杞花青素购于青海金麦杞生物科技有限公司(纯度61%、灰分0.6%、蛋白质6%、糖1.32%、氨基酸3.56%)；CCK-8试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司；DMEM干粉、胎牛血清均购自于Gibco公司；PBS购自Hfart公司；刀豆球蛋白(ConA) 购自XINTAI公司；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)购自MedChemExpress公司；胰蛋白酶EDTA溶液0.25%均购自Solarbio公司；山羊抗IgG购自Abcam公司；LC3-Ⅱ抗体购自BOSTER公司；Beclin-1抗体购自Biodragon公司；Ⅲ-PI3K抗体购自SAB公司；Ant-GAPDH购自Immunoway公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 主要仪器

超净工作台，购自江苏通净净化设备有限公司；CO2细胞培养箱，购自美国NUAIRE公司；高速低温离心机，购自英国Dynamica公司；酶标仪，购自意大利MuLTISKAN公司；Western blot 转膜仪，Western blot 电泳仪，Western blot 电源均购自北京六一生物科技公司；摇床购自美国SCILOGEX公司；化学发光成像仪购自北京赛智科技有限公司。

1.3 试剂配制

黑枸杞花青素溶液的配制：将黑枸杞花青素溶解于DMEM培养基中，配置浓度为100 μg/mL 的黑枸杞花青素溶液为母液稀释使用，4 ℃冰箱避光保存；刀豆球蛋白(ConA)溶液的配制：取出2.5 mg的ConA粉末，溶解在1 mL的DMEM培养基中作母液稀释使用，试验中ConA最终浓度为2.5 μg/mL，-20 ℃保存备用；3-MA抑制剂配制：称取0.015 g 3-MA 溶于1 mL培养基，37 ℃培养箱放置2 h，溶解配制成浓度为100 mM/L的母液稀释使用，置于4 ℃冰箱保存使用，试验中3-MA最终浓度为5 mM。

1.4 细胞培养

将小鼠巨噬细胞Raw264.7 置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液进行培养，每24 h换一次液，待细胞生长约70%～80%融合时将其传代，2～3 d进行一次细胞传代，传代培养足够的细胞以备用。

1.5 CCK8检测细胞活力

待细胞传代至足量后，调整细胞浓度为1×106，取体积为100 μL的细胞接种至96孔板，常规培养，每组三个重复，待细胞达到70%～80% 融合时，对细胞进行处理。黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的浓度分别为0、12.5、25、50、100 μg/mL，以0 μg/mL为对照组，并设不加细胞的空白组，分别在细胞培养箱中培养12 h、24 h、36 h、48 h之后加入10 μL的CCK-8试剂继续孵育2 h之后用酶标仪测定波长在490 nm处的OD值；刀豆球蛋白(ConA)结合花青素的试验与上述一致，但ConA最终浓度为2.5 μg/mL。细胞活力%=[(试验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%。

1.6 Western Blot 检测自噬因子蛋白的表达

分别收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。用30 μL 5×上样缓冲液与120 μL蛋白样本混合于200 μL的离心管中，于PCR仪上变性，经SDS-PAGE 电泳后，半干转转膜至PVDF膜，按比例配制 LC3-Ⅱ抗体、Beclin-1抗体、Ⅲ-PI3K抗体、及 GADPH 抗体，4 ℃封闭过夜，TBST洗膜，室温5×6 min摇洗，加入山羊抗IgG二抗，室温1 h后TBST洗膜，室温5×6 min摇洗。将保鲜膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，将PVDF膜正面(蛋白附着面)朝上，放置于薄膜里。将发光液试剂盒中两种液体按1∶1比例混合、摇匀。滴加到PVDF膜上，反应5 min。用镊子夹起PVDF膜一角，使发光液自然流下，曝光显影观察。

1.7 数据处理

采用Image J对条带量化，所有试验数据经Excel软件初步处理后，采用SPSS Statistics 21统计软件进行方差分析，LSD法进行多重比较，表中数据以“平均数±标准差”表示，利用Origin Pro 9.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响

由图1可以看出，用不同浓度黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7，与对照组相比，25 μg/mL的黑枸杞花青素诱导12 h、24 h、36 h、48 h细胞活力均显著增加(P<0.05)，且24 h细胞活力最高；其他组与对照组相比，作用24 h细胞活力有所提高，但差异不显著(P>0.05)。

图1 不同浓度黑枸杞花青素在不同时间对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响*.差异显著(P<0.05)，**.差异极显著(P<0.01)。下同。Fig.1 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts of different concentrations on cell viability of mouse macrophage RAW264.7 at* means significant difference (P<0.05)，** highly significant difference (P<0.01).The same below.

2.2 黑枸杞花青素结合ConA对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响

由图2结果可知，不同浓度黑枸杞花青素结合ConA能提高小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞活力，并与剂量、时间有一定关系。与对照组相比，花青素(25 μg/mL)+ConA、50 μg/mL+ConA、100 μg/mL+ConA作用时间12 h、24 h、36 h、48 h的细胞活力均显著增加(P<0.05)；与对照组相比，12.5 μg/mL+ConA作用时间24 h细胞活力显著增加(P<0.05)，作用时间12 h、36 h、48 h没有显著变化(P>0.05)。

图2 不同浓度黑枸杞花青素结合ConA对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响Fig.2 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts of different concentrations combined with ConA on cell viability of mouse macrophage RAW264.7 at different time

2.3 黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达的影响

如图3所示，与对照组相比，花青素各浓度组中LC3-Ⅱ的蛋白表达显著性降低(P<0.01)，呈浓度依赖性，花青素浓度越高LC3-Ⅱ的蛋白表达降低越多；与对照组相比，花青素各浓度组中的Beclin-1的蛋白表达也显著性降低(P<0.01)，呈浓度依赖性，花青素浓度越高Beclin-1的蛋白表达降低越多。

图3 不同浓度黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达的影响Fig.3 Effects of different concentrations of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts on the expression of autophagy factor LC3-Ⅱand Beclin-1 protein in mouse macrophage RAW264.7

2.4 黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬Ⅲ-PI3K调控通路的影响

如图4所示，与对照组相比，Beclin-1和Ⅲ-PI3K的花青素组，3-甲基腺嘌呤组和花青素+3-甲基腺嘌呤组都显著降低(P<0.01)。与3-甲基腺自嘌呤组相比，Beclin-1的花青素组高于3-甲基腺嘌呤组，但差异不显著(P>0.05)，花青素+3-甲基腺嘌呤组显著降低(P<0.01)；与3-甲基腺嘌呤组相比，Ⅲ-PI3K的花青素组显著高于3-甲基腺嘌呤组(P<0.01)。花青素+3-甲基腺嘌呤组显著降低(P<0.05)。

图4 黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬Ⅲ-PI3K调控通路相关因子蛋白的影响与3-MA组相比#表示差异显著(P<0.05) ,##表示差异极显著(P<0.01)Fig.4 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts on proteins related to autophagy Ⅲ-PI3K regulation pathway of mouse macrophage RAW264.7Compared with 3-MA group,# means significant difference (P<0.05),## highly extremely significant difference (P<0.01)

3 讨 论

巨噬细胞(Macrophages)是机体先天固有免疫的重要组成部分之一，巨噬细胞不仅能够清除体内坏死的细胞，还能清除入侵机体的病原体。花青素属于酚类中的类黄酮物质，是一类植物中广泛存在的水溶性天然色素，具有抵抗炎症、抗氧化、抗肿瘤细胞增殖的功效[9]。研究表明，不同浓度的葡萄籽花青素具有促前脂肪细胞增殖的作用，能有效抑制脂肪沉积[10]。王禹等[11]通过用不同剂量的紫甘薯花青素饲喂小鼠，发现紫甘薯花青素能够显著保护肝组织的损伤，提高肝细胞的增殖能力。细胞活力的大小也能反映细胞的增殖能力，本试验结果显示，25 μg/mL的黑枸杞花青素能显著提高小鼠巨噬细胞RAW264.7的活力促进其增殖；50 μg/mL和100 μg/mL浓度的黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7活力影响差异不显著，表明随着花青素浓度的升高，对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力下降。为验证结果的科学性，利用不同浓度的黑枸杞花青素结合刀豆球蛋白(ConA)检测其对小鼠巨噬细胞RAW264.7活力的影响，ConA能促进细胞分裂(促有丝分裂作用)，增加细胞活力。结果表明浓度为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL均能显著提高细胞活力且时间为24 h最佳。

研究表明，细胞自噬普遍存在于真核生物细胞中，它与细胞的增殖、凋亡、衰老息息相关。但自噬导致的细胞死亡和细胞凋亡不同，因此被称为Ⅱ型程序性细胞死亡[12]。在自噬的发生过程中，有很多的自噬相关蛋白参与。自噬相关蛋白是由自噬的相关基因编码产生，目前发现的自噬相关基因有40多个。其中Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性基因[13]，是酵母中 Atg6/VPs30 的同源基因，主要是通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶( ClassⅢPI3K) 形成复合体来调节其他自噬相关基因编码蛋白，并在自噬前体结构中定位，从而调节自噬活性[14]。LC3-Ⅱ自噬因子在自噬体的形成过程中起关键性作用，LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合，参与自噬溶酶体(Autolysosome) 的形成因此LC3-Ⅱ自噬因子被用作自噬形成的标志[15]。本试验用不同浓度的黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7检测自噬因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达，结果发现黑枸杞花青素抑制了Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达，且对浓度有依赖性。表明黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7的自噬有抑制作用，且浓度越高，抑制作用越强。

研究表明，Ⅲ-PI3K自噬调控通路中起核心作用的是Ⅲ-PI3K-Beclin-1复合体，该复合体由Beclin-1、Bcl-2、UVRAG和Ⅲ-PI3K组成，其在自噬形成的早期阶段对自噬体的成熟和运输起到关键作用[16]。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)是一种常用的自噬抑制剂，其机制是通过抑制Ⅲ-PI3K而阻碍自噬体形成。本试验结果表明，黑枸杞花青素能抑制Ⅲ-PI3K通路上因子的蛋白表达，且在3-MA的作用下，黑枸杞花青素显著降低了Ⅲ-PI3K和Beclin-1的蛋白表达，表明黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬可能与Ⅲ-PI3K自噬调控通路有关。

4 结 论

本研究结果表明，黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的最佳浓度为25 μg/mL，最佳作用时间为24 h；同时黑枸杞花青素能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬，其调控机理可能与Ⅲ-PI3K自噬调控通路有关。