饲喂NAC对努比亚山羊CCL21、CCL26基因表达量的影响

骆金红，陈 祥，尚以顺

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006)

努比亚山羊(Nubian goat)肉质细嫩、乳脂率高、繁殖力强[1]，是从以利比亚为中心的非洲北部地区引入我国的乳肉皮兼用型山羊品种，以胎产1羔或2羔占比较多，部分可胎产3羔或4羔。如何尽可能的减少由于同期发情处理、人工输精等造成的应激以及阴道、子宫等的损伤、感染，保证胚胎的良好发育及附植，提高努比亚山羊胎产3羔或4羔比例，对于山羊养殖业具有重要意义。NAC(N-acetylcysteine，NAC)分子式为C5H9NO3S，相对分子质量163.2，是左旋精氨酸的天然衍生物，是还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)与天然L-半胱氨酸的前体，是一种含活性巯基化合物，其作用主要有增加细胞外巯基浓度，提高谷胱甘肽-S-转移酶活性[2-3]，促进细胞内GSH的生物合成[4]，能有效清除细胞内自由基，具有良好的抗氧化作用[5]，可有效的减少子宫内感染并抑制炎症以促进生殖[6]。团队前期的研究结果表明，努比亚山羊妊娠早期饲粮中添加0.07%的NAC提高了胎产羔数，通过子宫转录组测序结果我们推测其可能是通过促进/抑制发育和免疫两类相关基因的表达发挥作用，并从中筛选出了免疫相关基因CCL21和CCL26。

CCL21和CCL26同属CC类趋化因子家族成员，家族28个成员同源性为25%～70%，N端第1或第2个Cys(半胱氨酸)相连[7]。自1955年第一个趋化因子(CXCL4)发现以来[8]，现在已经相继发现了趋化因子家族成员50多种，相关受体家族成员20多种。趋化因子是一类低分子分泌蛋白，能趋化细胞向感染或其他特殊器官、部位的移行；趋化因子受体是一类GTP-蛋白偶联的跨膜受体，介导趋化因子的功能行使，通常在内皮细胞、免疫细胞等细胞膜上表达[9]。趋化因子和与之对应的GTP-蛋白偶联受体结合，在免疫细胞的发育、分化调控、定向迁移等方面发挥作用[10]。CCL21是次级淋巴组织趋化因子，属于CC类趋化因子家族中成员，在扁桃体、淋巴结、淋巴内皮、脾脏T细胞富集区及非淋巴组织的内皮淋巴导管中特异性高表达[11]，基因位于染色体9p13.3。CCR7是CCL21的高亲和力受体，二者结合后可趋化B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞等多种免疫细胞，参与自身相关免疫反应、病变[12]。CCL21与其他趋化因子比较有两个不同特点，一是对中性粒细胞、单核细胞无趋化作用[13]，二是可通过促进血管抑制因子的分泌抑制血管生成[14]。CCL26基因位于染色体7q11.23，编码巨噬细胞炎性蛋白，作用于嗜酸性粒细胞、T细胞，是受体CCR3的激动剂，也是受体CCR5、CCR2、CCR1的拮抗剂[15]，通过调控细胞的生长和转移在肿瘤细胞的增殖和炎性细胞的趋化等病理生理过程中发挥重要作用[16]。

本试验通过实时荧光定量PCR技术对CCL21和CCL26基因在努比亚山羊垂体、输卵管、子宫、下丘脑、卵巢5个性腺轴组织的表达量进行分析，研究结果可为揭示NAC通过免疫相关调节在提高努比亚山羊产羔数中的作用机理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在贵州某畜牧业开发有限公司春季(5月)选取配种后健康的经产努比亚山羊(产2～4胎)母羊32只，平均随机分为试验组和空白组，试验组在饲粮中添加0.07%的NAC，空白组正常饲喂。配种当天记为第0天，从第1天开始饲喂NAC，第30天时试验组和空白组各随机选取3只羊颈静脉放血处死后采集垂体、输卵管、下丘脑、卵巢、子宫5个组织，锡箔纸封装、编号放入液氮中，带回实验室后立即转入-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要仪器

微量移液器(型号Eppendorf)，购自德国艾本德公司；PCR扩增仪(型号C1000 TouchTM)、凝胶成相系统(型号Universal Hood II)、电泳仪(型号PowerPacTM HV Power Supply)、实时荧光定量PCR仪(型号CFX96 Real-Time System)，均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 主要试剂

1.4 组织RNA的提取

采用TRIzol法提取组织总RNA，按照组织磨粉、TRIzol裂解、氯仿分相、离心、异丙醇沉淀核酸、离心、75%乙醇去除杂质及洗去氯仿及异丙醇、离心、DEPC水溶解及孵育步骤获得组织RNA。获得的RNA用紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，1%的琼脂糖凝胶检测RNA特异性，分装保存。

采用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(ThermoFisher，美国)将检测合格的总RNA反转录为cDNA。

1.5 实时荧光定量PCR

1.5.1 引物的设计 依据GenBank中收录的山羊CCL21(登录号为JO580733.1)、CCL26(登录号为JO579875.1)和β-actin(登录号为NC_030832.1)基因序列及其mRNA序列，利用NCBI中Primer-BLAST在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计特异性荧光引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列见表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5.2 实时荧光定量PCR 根据SYBR Green 1试剂盒的方法及体系推荐，将cDNA模板用CFX 96 Real-Time PCR检测系统，运用单因素变量的方法对最佳退火温度、最适引物浓度进行摸索、优化，确定试验的最佳退火温度和最适引物浓度。实时荧光定量PCR扩增体系(总体积为20 μL)：各组分为2×T5 Fast qPCR Mix(1×)10 μL ，上下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，50×ROX Reference Dye I(1×)0.4 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7 μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性13 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共43个循环；95 ℃，15 s，最后按0.5 ℃/s从65 ℃缓慢上升到95 ℃进行溶解曲线分析，荧光采集时间为5 s。本试验每个样品进行3管平行实验，所用引物浓度为100 ng/μL。

1.6 数据的统计分析

根据2-△△Ct法分析CCL21和CCL26基因表达量，组内比较用单因素方差分析(Duncan法)，组间分析用配对样本t检验进行分析，组内、组间分析均用SPSS 20.0进行分析，P<0.05代表差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 CCL21基因在不同组织的表达分析

由图1可知，对空白组和试验组努比亚山羊垂体、输卵管、子宫、下丘脑、卵巢5个性腺轴组织中CCL21基因表达量进行分析，CCL21基因在空白组和试验组努比亚山羊的5个组织中均有表达。CCL21在空白组垂体中表达量高于下丘脑和子宫(P<0.05)，高于卵巢和输卵管(P<0.01)，由高到低依次为垂体>下丘脑>子宫>卵巢>输卵管；试验组垂体中表达量高于子宫、卵巢、输卵管(P<0.01)，下丘脑中表达量高于子宫、卵巢、输卵管(P<0.05)，由高到低依次为下丘脑>垂体>子宫>卵巢>输卵管；组间比较，相同组织之间表达量无显著变化(P>0.05)。

图1 努比亚山羊不同组织中的CCL21基因的相对含量同组不同组织柱标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同组同一组织比较有无“*”表示差异显著(P<0.05)。下同。Fig.1 The relative expression of CCL21 gene in different tissues of Nubian goatsDifferent uppercase letters in different tissues in the same group indicate a significant difference (P<0.01),and different lowercase letters indicate a significant difference (P<0.05);the presence or absence of “*” in the same tissue in different groups indicates a significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 CCL26基因在不同组织的表达分析

由图2可知，CCL26基因在空白组和试验组努比亚山羊的5个组织中均有表达。在空白组中，CCL26基因在垂体中表达量高于输卵管、下丘脑、卵巢、子宫(P<0.01)，下丘脑中表达量高于输卵管、卵巢(P<0.05)，由高到低依次为垂体>下丘脑>子宫>卵巢>输卵管；在试验组中，垂体、下丘脑中表达量均高于输卵管、卵巢(P<0.01)，下丘脑中表达量高于输卵管、卵巢、子宫(P<0.05)，由高到低依次为垂体>下丘脑>卵巢>子宫>输卵管；组间比较，卵巢组织中表达量试验组高于空白组(P<0.05)，其他4个组织表达量无显著变化(P>0.05)。

3 讨 论

NAC不仅在抑制炎症、细胞凋亡、呼吸道感染、肝脏保护等方面具有一定的作用[17]，在减轻胎儿(胚胎)畸形[18]、提高胚胎存活和预防早产[19-20]等繁殖方面的作用也逐渐被发现。田见晖等[21]研究发现，补充NAC能促进小鼠和猪胚胎附植，提高了其窝产仔数。本试验中趋化因子基因CCL21和CCL26就是在妊娠早期补充NAC提高努比亚山羊产羔数基础上通过子宫转录组测序筛选获得，且本试验结果与转录组测序结果上、下调趋势一致。

Tríbulo等[22]研究发现，CCL21在发情周期第0天的荷斯坦牛输卵管和子宫内膜中高表达，CCL26在相同状态的子宫内膜中高表达，提示CCL21、CCL26可能在繁殖性能方面也发挥某些未知作用。本试验中CCL21、CCL26在试验组和空白组性腺轴组织垂体和下丘脑中高表达，子宫、卵巢、输卵管中相对低表达，说明妊娠期垂体和下丘脑趋化活动较靶器官子宫、卵巢、输卵管中更频繁，这可能与垂体和下丘脑在妊娠期间发挥更重要的调控作用有关。研究表明，许多自身免疫性疾病和慢性炎症与趋化因子或趋化因子受体的不适当调节有关[23]。Lee等[24]研究发现，类风湿关节炎患者CCL21和其受体CCR7的表达量高于骨关节炎患者和空白组，且发现依赖于CCR7的CCL21提高了骨吸收的活性和破骨细胞的移行能力。魏蔚霞等[25]研究发现，盆腔子宫内膜异位症(EMS)患者子宫内膜组织及腹腔液中CCL21高表达，且与EMS呈正相关。本试验组间比较发现，饲喂NAC对CCL21表达无显著影响。CCL26 能够介导炎性细胞的趋化、肿瘤细胞的增殖等生理病理过程，特别是调节肿瘤细胞的生长和转移能力[26]，本试验组间比较发现，NAC的饲喂降低了垂体、输卵管、子宫中CCL26基因表达量，增加了下丘脑、卵巢中的表达量，且在卵巢组织中达到差异显著水平(P<0.05)，结合产羔数的提高，推测CCL26对某些未知的繁殖调控因子也具有趋化作用，进而保证了胚胎的良好发育和存活，提高了努比亚山羊产羔数，但NAC的饲喂是否有增加卵巢发生炎症的可能需要更进一步同时研究。

4 结 论

CCL21、CCL26基因在努比亚山羊垂体、输卵管、子宫、下丘脑、卵巢5个性腺轴组织中均有不同的表达；在饲喂NAC后，组织中CCL21的表达没有受影响，但显著上调了卵巢CCL26的表达，即NAC可通过卵巢CCL26对生殖功能进行调节。