兰坪乌骨绵羊黑色素及其候选基因研究进展

岳 丹,刘兴能,熊和丽,2,和晓明,彭超超,朱俊红,邓卫东*

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，昆明 650201;2.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650201)

绵羊不仅是生产肉和毛的重要农业牲畜之一，还是生物学和比较基因组学研究的理想动物模型。与普通绵羊比，兰坪乌骨绵羊的皮肤、肌肉、骨骼、内脏颜色均较深(黑色)[1]，与乌骨鸡相关研究一致，该颜色是由于存在过多的黑色素所致[2]。并且兰坪乌骨绵羊的深色特征在杂交试验中被发现具有遗传现象[3]。乌骨乌肉特征主要依赖于其体内含有丰富的黑色素，前人做了大量试验，并推测兰坪乌骨绵羊真黑色素的沉积受多基因调控[4]。如果能进一步从分子水平探明黑色素合成机理并找出其主效基因，将有利于黑色素在动物体内的沉积，更有利于黑色素产品的开发与利用，从而推动黑色素的食用价值和药用价值。

1 黑色素的形成

Berzelius于1840年首次使用黑色素(Melanin)这一名称[5]。天然黑色素是一类含氮高聚物，由酚酞和吲哚类物质经过氧化聚合而成的生物色素[6]。主要分黑/棕色的真黑素和红/黄色的脱黑素两种类型，两类的区别在于是否含有硫原子，不含硫原子的为黑/棕色的真黑色素；含有硫原子的为红/黄色的脱黑色素[7]。目前已有研究表明，黑色素细胞的形成经历四个阶段：黑色素小体形成、黑色素小体成熟、黑色素合成和黑色素小体转运[8]。黑色素细胞的合成过程如图1所示。

黑色素小体起始于黑色素细胞内的多囊泡内体(multivesicular endosomes/bodies，MVBs)。色素细胞特异性蛋白质前黑色素小体蛋白(premelanosome protein，PMEL)在MVBs中经加工形成淀粉样纤维基质，诱导黑色素的原纤维产生[9]。研究表明原纤维的扩展促进了未成熟黑色素小体的延长[10]，因此，依赖PMEL的原纤维形成是黑色素细胞内黑色素小体延长所必需的。其次，酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,TRP-2)的活性是黑色素合成的关键因素，在黑色素小体成熟阶段，TYR、TRP-1、TRP-2选择性转运至黑色素小体[11]。眼白化病基因(ocular albinism 1，OA1)能在黑色素小体的膜和内吞溶酶体中表达，影响其与前黑色素小体蛋白17(premelanosome protein 17，PMEL 17)的相互作用进而影响黑色素小体的结构[12]。OA1基因编码的OA1蛋白是一种黑色素小体膜蛋白，具有连接溶酶体和黑色素小体的作用[13]；黑色素瘤T细胞抗原(melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART-1 或MLANA)与PMEL 17相互结合形成复合体，影响黑色素小体的成熟[10]；膜相关转运蛋白(membrane associated transporter protein，MATP)也对黑色素小体的成熟有重要影响，主要会导致黑色素小体形成紊乱，造成黑色素含量减少[12]。以上研究显示，黑色素小体的有效成熟以及酪氨酸酶等物质的活性与黑色素的合成有着密切的相关性，阻断黑色素小体的成熟是减少黑色素合成的关键。α-黑色素细胞刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)与黑皮质激素-1受体(melanocortin-1 receptor，MC-1R)结合可诱导环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)增加从而引发小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)的表达上调，MITF编码的产物主要调控TYR、TRP-1和TRP-2的活性，进而促进真黑色素的合成[14-16]。在黑色素小体的转运过程中，OA1基因起着关键作用，黑色素-黑色素小体运输到周围的角质细胞受OA1基因的调控，每个成熟的黑色素-黑色素小体与周围的角质细胞构成一个功能单位，由每个功能单位共同来完成黑色素的运输与代谢[17]。同时，GTPase家族蛋白RAB27A以及效应因子黑色素亲和素SLAC2A和肌动蛋白相关的肌球蛋白Va(114-116)形成三聚体的复合物是黑色素转运的关键，并且研究表明MITF基因编码的产物能促进RAB27A蛋白的表达，进而影响黑色素的转运[18]。

2 影响兰坪乌骨绵羊的相关基因

2.1 酪氨酸酶(TYR)基因家族

黑色素的合成受一系列酶学反应的控制，TYR是黑色素合成的关键酶[19]。在黑色素的合成过程中，除了对TYR的活性有要求外，对TYR同源基因的酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)和酪氨酸相关蛋白2(TYRP-2)的需求也是必需的[20]。Saranggarajan 等[21]研究表明，TYRP-1影响黑色素细胞的增殖和黑色素小体的成熟；TYRP-1还参与黑色素小体结构的完整性并影响黑色素细胞的增殖和凋亡[22]。黑色素细胞培养实验表明，ASP通过拮抗a-MSH抑制环磷酸腺苷(cAMP)在黑色素细胞内的表达水平，进而抑制TYRP-1和TYRP-2的表达量，降低了真黑色素的合成量[23]。

表1 TYR基因家族影响兰坪乌骨绵羊黑色素合成代谢的研究Table 1 TYR gene family affects melanin anabolic metabolism in Lanping black-bone sheep

Deng[3,24-25]研究显示兰坪乌骨绵羊比兰坪普通绵羊有显著高的酪氨酸酶活力和血浆比色。李文[26]通过对TYR基因的A945G和C1440G位点设计 PCR-SSCP 检测 TYR基因多态性，发现扩增的基因型与绵羊毛色没有显著差异。王鑫玉[27]的试验显示高活力的TYR导致总黑色素和真黑色素合成显著增多、兰坪乌骨绵羊血浆比色显著高于普通绵羊，但对绵羊毛色并无显著差异。兰坪乌骨绵羊组织器官中黑色素含量与绵羊毛色深浅成正比关系，但是血浆中总黑色素的含量与毛色并无这一规律。所以可以推断，影响乌骨乌肉形成的黑色素沉积机制是区别于影响皮肤毛囊之外的机制或多者兼而有之，还有待进一步研究讨论。曹绣娟[28]对TYRP1基因的C1107T、C1107T和A1470C位点互作效应对兰坪乌骨绵羊乌质性状进行研究，其结果与Li等[29]一致，兰坪乌骨绵羊的组织器官中黑色素及相关色素含量高于普通绵羊与罗姆绵羊的结果并不是由于TYRP1基因编码SNP的变异造成的；谭玉文[23]研究显示TYRP2基因的A605G位点在各种毛色绵羊之间没有显著性差异。与何奕多等[30]研究一致，TYR、TYRP1、TYRP2三个基因在兰坪乌骨绵羊和兰坪普通绵羊中的表达量无显著差异。前人做了大量TYR基因家族与黑色素合成的相关性研究，显示TYR基因家族与兰坪乌骨绵羊被毛颜色和乌骨乌肉特征没有显著关联。但在黑色素合成过程中毋庸置疑TYR基因家族起着十分重要的作用。

2.2 RAB基因家族

Rab蛋白是膜相关GTP酶中的大家族，Rab蛋白与GTP结合可调节细胞内囊泡运输，但与GDP结合失去活性。大量研究表明Rab-GTP酶家族在控制黑小体的合成和转运中起十分重要的作用[31-33]。

表2 RAB基因家族影响兰坪乌骨绵羊黑色素合成代谢的研究Table 2 RAB gene family affects melanin anabolic metabolism in Lanping black-bone sheep

膜相关GTP酶家族中的一员RAB21基因编码的RAB21蛋白。RAB21蛋白被Varp的 VPS9 结构域激活后，调节黑色素细胞树突的形成。RAB21基因的突变可能导致RAB21蛋白的构象发生改变，从而对黑色素细胞树突的形成造成影响，进而导致黑小体转运至周围的角质细胞[34]。将兰坪乌骨绵羊与普通绵羊RAB21基因的EX1-A90G、EX2-A207T以及EX3-T237C多态位点的基因型与血浆中黑色素含量指标进行关联分析，结果兰坪乌骨绵羊的杂合度、有效等位基因数、多态信息含量均高于普通绵羊。在相同基因型不同绵羊类群中，除总黑色素外，兰坪乌骨绵羊其他指标(血浆比色、TYR活性等)均高于普通绵羊。在EX2-A207T位点处，只存在于兰坪乌骨绵羊中AA基因型绵羊的血浆比色含量显著高于TA和TT型，因此可推断AA基因型为兰坪乌骨绵羊的优势基因[35]。

He等[36]基于牛或其他哺乳动物和高度同源的绵羊EST的保守序列信息，克隆了兰坪乌骨绵羊RAB2A、RAB3A和RAB7A基因的编码序列并对确定的核苷酸序列进行了序列分析和必要的功能分析。结果显示，兰坪乌骨绵羊RAB2A基因在心脏、肝脏、肾脏、背最长肌和腿部肌肉组织中适度表达，而在脾脏和皮肤组织中几乎无表达；兰坪乌骨绵羊RAB3A基因在脾脏和肝脏中活跃，在心脏、肾脏、腿部肌肉、背最长肌和皮肤中无表达；兰坪乌骨绵羊RAB7A基因在肝脏中过表达，在心脏、脾脏、肾脏、背最长肌和皮肤中表达较弱，而在腿部肌肉中则几乎不表达。研究表明，RAB7A基因可通过调节溶酶体降解来控制细胞的生长、迁移和分化，从而控制表皮生长因子和表皮生长因子受体复合物的内吞运输，RAB7A的GTP结合形式还通过调节黑色素瘤细胞的成熟来促进黑色素生成[37]。但崔嘉[38]的研究显示RAB7A基因G805A 位点的多态性与兰坪乌骨绵羊乌质性状于毛色没有显著关联，RAB7A基因的表达丰度与兰坪乌骨绵羊各组织中黑色素含量是否相关需进一步研究。以上研究表明，RAB基因家族对兰坪乌骨黑色素合成的影响存在种间关系，具体的影响机理还需进一步试验。

2.3 SLC基因家族

陈禹翰[39]利用RNA-Seq技术，分析检测兰坪乌骨绵羊和普通绵羊的SNP，发现在谷胱甘肽代谢通路(Ko00480)中，酶 EC2.5.1.18 为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。过量谷胱甘肽(GSH)能够在体内多巴醌多巴向下一代谷氨酰转肽酶(r-GTP)半胱氨酸多巴的行动中迅速形成谷胱甘肽多巴，谷胱甘肽多巴会导致黑色素的表达水平下调。而SLC7A11基因编码的蛋白质(xCT)负责将细胞外的胱氨酸转运至细胞内，直接调节毛发中黑素细胞脱色素的产生[40]。老鼠而SLC7A11基因突变后xCT蛋白缺失，直接影响毛色由红色变为灰色，显著降低了毛发中脱黑色素的含量，但奇怪的是真黑色素含量不受影响[40]。假设敲除SLC7A11基因或将GSH与其他化合物作用，减少谷胱甘肽多巴的形成，进而减少其对黑色素生成的影响，因此是否会使兰坪乌骨绵羊黑色素沉积增加，还需要进一步研究。Lamason[41]研究显示，SLC24A5基因在黑色素合成过程中对其pH有相应影响，但崔嘉[42]研究表明，SLC24A5基因在乌骨绵羊中存在 6 个多态位点，3个位于内含子上，还有2个错义突变 ( G762C 和 G805A) 和 G933A 同义突变位于外显子处。SLC24A5基因的多态位点对兰坪乌骨绵羊的乌质特征并无显著影响。就现有的研究显示，SLC基因家族对兰坪乌骨绵羊黑色素的形成无显著关联。

2.4 黑皮质素受体1(MC1R)基因

MC1R基因编码的MC1R蛋白通过腺苷酸环化酶调控黑色素的合成种类，是影响黑色素形成的重要基因之一。Deng[25]对MC1R基因的整个编码区进行了测序，并发现了A12G和G144C两个沉默突变位点。PCR-RFLP结果显示，GG基因型羊比CC基因型羊在混合羊组中表现出更高的酪氨酸酶活性。具有GG和GC基因型的绵羊在兰坪乌骨绵羊中表现出显着的黑色被毛，然而CC基因型的绵羊在普通绵羊中其主要的繁殖特性总是呈现白色被毛。该发现与以前的研究结果相似，即黑皮肤中的酪氨酸酶活性强于白皮肤。因此，等位基因G和C可能分别有助于高酪氨酸酶活性的表达。舒文[43]研究表明，MC1R与Agouti信号蛋白(ASIP)之间的相互作用对酪氨酸酶蛋白家族(TYR、TYRPl、TYRP2)的3个酶活性的表达水平有重要影响，结果分析发现兰坪乌骨绵羊和兰坪普通绵羊MC1R基因的频率差异不显著。可以推测MC1R基因不是影响兰坪乌骨绵羊毛色和乌质性状的主效基因。

2.5 小眼畸形相关转录因子(MITF)

MITF基因是小眼畸形相关转录因子，早在1993年小鼠MITF基因被克隆并发现其基因位于mi位点[44]。小鼠中该基因的结构基因由9个外显子构成，编码由419个氨基酸残基构成的MITF蛋白[45]。研究发现，MITF基因对黑色素细胞存活、迁移、繁殖和分化起着决定性作用[46]。Kijas等[47]关于MITF基因在藏羊的研究表明，MITF表达可以影响黑色素沉积，从而影响被毛颜色。李春艳等[48]的研究利用MITF基因在苏尼特羊(典型的季节性发情品种)和小尾寒羊(典型的常年发情品种)的组织表达特征在不同繁殖状态下绵羊各组织中的表达差异以及该基因表达与绵羊产羔数的关系。采样下丘脑等组织，通过 PCR 技术探索MITF基因在不同繁殖状态下绵羊不同组织的表达情况。结果表明，MITF基因在两个绵羊品种的不同组织中有表达，并且在子宫、输卵管及卵巢中表达量较高。宛梦雅[49]采用100 只兰坪乌骨绵羊、96只兰坪普通绵羊血液，测定血浆酪氨酸酶活力、黑色素含量等血液生化指标。通过对MITF基因的扩增，结果显示乌骨绵羊与普通绵羊MITF基因的C491T位点处，具有CC基因型的绵羊酪氨酸酶活力、脱黑色素、碱溶性黑色素和血浆比色的值显著高于绵羊AA和TC型，因此可推测CC基因型为乌骨绵羊的主要基因型，但具体影响机理还需进一步研究。

2.6 其他基因

Xi等[50]克隆了兰坪乌骨绵羊Sfxn1，Snai2和Cno基因的完整编码序列并进行了序列分析和组织表达分析，发现兰坪乌骨绵羊Sfxn1基因在肾脏中高度表达，在心脏、肝脏和腿部肌肉中中度表达，在脾、背最长肌和皮肤几乎没有表达；兰坪乌骨绵羊Snai2基因在脾脏和肾脏中过表达，在心脏、肝脏和背最长肌中弱表达，腿部肌肉和皮肤几乎没有表达；兰坪乌骨绵羊Cno基因在脾脏、肾脏和腿部肌肉中表达，在心脏、肝脏、背最长肌和皮肤中几乎不表达。绵羊Sfxn1、Snai2和Cno基因与牛的Sfxn1、Snai2和Cno基因具有高度同源性并具有相同域。这意味着绵羊和牛的Sfxn1、Snai2和Cno基因表现出类似的功能。试验表明，绵羊Sfxn1、Snai2和Cno基因编码的蛋白比牛的遗传关系更紧密。这说明它们的功能在不同物种又有所不同。这意味着即使它们在一个个体或一个物种中，不同的基因也具有不同的进化模式。

本课题组研究影响黑色素合成代谢主要因素的结果表明，兰坪乌骨绵羊中TYR基因是影响黑色素沉积的主要原因，TYR酶活性对黑色素有限制作用；RAB基因家族的表达丰度可能与乌质性状存在关联；SLC基因家族就目前的报道来看，与黑色素的形成没有显著关联，但SLC7A11与GST互作效应对兰坪乌骨绵羊乌质性状的影响需进一步研究。目前，本课题组正在积极探索基因对乌骨绵羊控制乌质性状的机理进行试验。

3 研究展望

兰坪乌骨绵羊有着与乌骨鸡一样的药用价值和食用价值，虽然本课题组就兰坪乌骨绵羊黑色素生成的途径做了大量相关试验，但目前控制兰坪乌骨绵羊乌质性状的主效基因尚未确定，也没有探明黑色素相关功能基因之间的相互关系，并对黑色素集中扩散的机制仍然处在探索与推测阶段。对黑色素相关功能基因的研究，还需要进一步从分子水平找到主效基因，进而阐明相关基因之间的相互关联，为兰坪乌骨绵羊的保护、开发和利用提供理论基础。