益生性酵母菌的筛选与鉴定

姚志芳，冯宇哲，王 磊,2*，吴国芳,2，何江波

(1.青海大学 畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；2.青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016；3.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

近年来，我国畜牧业快速发展，饲粮短缺和供需不平衡问题日益突出。开发菌体高蛋白饲料资源，优化饲粮生产结构，提高饲料利用率已成为发展畜牧业的重要途径[1]。饲料作物的安全性和有效性与国家口粮的安全息息相关，生产安全优质的饲料和建立高效的生产体系对畜牧业持续健康发展具有重要的积极影响[2]。饲料质量安全体系的建立和饲料质量安全水平的提高是饲料发展的重点任务之一[3]。因此，研发安全性生物饲料是保证动物性食品安全的关键。此外，抗生素在动物养殖中的滥用导致的耐药性、药物残留等副作用，给动物和人类健康带来严重危害，而益生菌制剂因其具有促进动物生长[4]、改善消化机能、提高瘤胃菌体蛋白[5]和免疫力等功效在畜牧业中被广泛应用，有效克服了使用抗生素所产生的一系列问题[6]。青海高海拔地区牦牛均在自然条件下放牧饲养，未使用抗生素等化学药物，自然环境未受到污染，同时西藏青稞在种植过程中未使用化学肥料和农药，使得牦牛瘤胃和青稞酒糟中的有益微生物未受到药物污染。基于此，本试验从青海牦牛瘤胃和西藏青稞酒糟中分离筛选生长性能良好的酵母菌，进一步研究其生理生化特性和益生特性，为后续酵母菌作为饲料添加剂提供一定的参考依据。

1 材料与方法1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 样品采自于青海牦牛瘤胃和西藏青稞酒糟。

1.1.2 培养基 YPD液体培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、1L蒸馏水，自然pH。YPD 固体培养基：在YPD 液体培养基中添加20 g/L琼脂粉。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化与筛选 用瘤胃液采集针抽取5头成年牦牛瘤胃液各10 mL，混匀后进行梯度稀释，分别取20 μL涂布YPD固体平板，28 ℃培养48 h。待长出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的形态、颜色等不同的单菌落进行反复纯化、镜检，并保存备用。取酒糟样品10 mL梯度稀释后，分别取20 μL梯度稀释菌悬液涂布YPD固体平板，28 ℃培养48 h。待长出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的形态、颜色等不同的单菌落进行反复纯化、镜检，并保存备用。

1.2.2 酵母菌的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 菌株细胞形态观察、培养特征、假菌丝形成、掷孢子形成等参照王加启《反刍动物营养学研究方法》进行[7]。

1.2.2.2 分子生物学鉴定 真菌基因组DNA的提取参照Omega真菌基因组DNA提取试剂盒说明进行。以基因组DNA为模板，PCR扩增酵母菌18S rDNA和26S rDNA基因片段。扩增所用引物序列如下：18S F：5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；18S R：5'-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3'。NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3'。反应条件参照常规PCR反应条件，并根据引物Tm值和片段长度修改退火温度和延伸时间。PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将测序结果进行在线BLAST比对分析，用 DNA Star软件进行同源性分析，并构建系统发育树。

1.2.3 酵母菌生理生化特性的测定葡萄糖发酵、类淀粉形成、尿素分解、肌醇分解、硝酸钾分解等试验参照林治宇[8]的方法进行。

1.2.4 酵母菌发酵特性的测定

1.2.4.1 生长曲线测定 将培养48 h后的酵母菌培养液按3%的接种量接入YPD 液体培养基中，28 ℃培养72 h。以未接种的YPD液体培养基为空白对照，在波长560 nm处测定各时间段酵母菌发酵液的吸光度(3个重复)。以培养时间为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标，采用Graphpad prism8.0软件绘制生长曲线。

1.2.4.2 产酸曲线测定 将培养48 h后的酵母菌培养液按3%的接种量接入YPD 液体培养基中，28 ℃培养72 h。测定各时间段酵母菌发酵液的pH(3个重复)。以培养时间为横坐标，相对应的pH为纵坐标，绘制产酸曲线。

1.2.4.3 耐酸测定 将YPD液体培养基的pH分别调制为1.5，2.0，2.5和3.0，将待测酵母菌按1%接种量接种到已调制好pH的YPD液体培养基中，28 ℃静置培养24 h后测定不同pH下酵母菌的OD560。

1.2.4.4 耐胆盐测定 在YPD液体培养基中分别加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，1%，1.5%和2%的牛胆盐，将待测酵母菌按照2%接种到已调制好胆盐浓度的YPD液体培养基中，28 ℃静置培养24 h后测定不同胆盐浓度下酵母菌的OD560。

1.2.4.5 药敏性测定 采用药敏纸片琼脂扩散法测量每种药物的抑菌圈直径(3个重复)。

1.2.4.6 抑菌性测定 采用牛津杯法测定酵母菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的抑菌圈直径(3个重复)。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离筛选与鉴定

2.1.1 酵母菌的筛选与形态学鉴定 如表1和图1所示，9株酵母菌均呈乳白色，JZ4和JZ10圆形微隆，菌落表面干燥，边缘呈放射状，有浮膜和菌丝形态；JZ5和JZ8圆形中央锥形突起，JZ6和JZ9圆形液滴状，MN24、MN25和MN29菌株圆形，中央礼帽状突起，该7株酵母菌菌落表面光滑，边缘整齐，均无浮膜和菌丝形态。

图1 酵母菌形态特征图注：A 酵母菌菌落形态；B 酵母菌显微镜(400×)形态；C 酵母菌显微镜(400×)菌丝形态Fig.1 Map of yeast morphological characteristics

2.1.2 酵母菌的分子生物学鉴定 图2所示，以菌株基因组DNA为模板，酵母菌18S rDNA和26S rDNA基因通用引物扩增，获得500～600 bp左右的目的条带，与预期大小相符；测序结果经Blast比对和系统发育树构建(图3)发现，JZ4和JZ10菌株与PichiakudriavzeviistrainCBS菌株的相似性达99%，为毕赤酵母菌；JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株与SaccharomycescerevisiaestrainY4菌株的相似性达99%，为酿酒酵母菌；MN24、MN25和MN29菌株与KluyveromycesmarxianusstrainJCABKM4菌株的相似性达99%，为马克斯克鲁维酵母菌。

图2 PCR扩增电泳图注：M 2kb DNA 分子质量标准；A 菌株 18S rDNA 基因扩增；B 菌株 26S rDNA 基因扩增Fig.2 PCR amplification electropherogramNote: M 2kb DNA molecular quality standard;A strain 18S rDNA gene amplification;B strain 26S rDNA gene amplification

图3 分离菌株 18S rDNA 序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strain 18S rDNA sequence

2.2 酵母菌生理生化特性的测定

如表2所示，9株酵母菌均不能同化硝酸钾，不产生类淀粉物质，MN24、MN25和MN29菌株发酵葡萄糖产酸且产气，其它菌株产酸且不产气；JZ9和JZ10能分解尿素发生脲酶反应，其它菌株不发生脲酶反应；JZ6和JZ9不同化肌醇，其它菌株均同化肌醇。

2.3 酵母菌发酵特性的测定

2.3.1 生长曲线测定 由图4可知，在接种量和培养条件一致时，JZ4、JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株在4 h时进入对数生长期，其中JZ5和JZ8菌株在20 h时进入稳定期，JZ6和JZ9菌株在24 h时进入稳定期，JZ4菌株在36 h时进入稳定期。而JZ10、MN24、MN25和MN29菌株在2 h时就已进入对数生长期，其中MN24和MN25菌株在32 h时进入稳定期，JZ10和MN29在44 h时进入稳定期。经比较可以看出：JZ10、MN24、MN25和MN29菌株起酵时间最短，环境适应性越强，生命力越旺盛；JZ5和JZ8菌株发酵完成时间最短；JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株的OD值最大，具有较强的发酵活性。

图4 酵母菌生长曲线图Fig.4 Yeast growth curve

2.3.2 产酸曲线测定 由图5可知，9株试验酵母菌生长发酵72 h后pH≥5.0，其中JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株在相对较短时间内产酸较多，12 h进入稳定期，pH降低到5.1左右；JZ4和JZ10产酸速度较慢，产酸较少，但差距不大，28 h进入稳定期，pH降低到5.2左右；MN24、MN25和MN29菌株产酸慢且产酸少，24 h进入稳定期。说明9株试验酵母菌产酸最终pH≥5.0，均能在各自产酸环境中正常生长。

图5 酵母菌产酸曲线图Fig.5 Yeast acid production curve

2.3.3 耐酸测定 由图6可知，在pH为3.0的酸性环境中，所有菌株生长较pH为6.5时的条件下减慢，但生长OD值变化基本在1左右，基本能正常生长；在pH为2.5的酸性环境中，JZ5和MN29菌株较其它菌株生长缓慢，JZ10和MN24比其它菌株生长速度较快；在pH为2.0的酸性环境中，所有菌株生长变化很小，在pH为1.5时基本停滞生长。试验菌株均可在pH为3.0的低酸环境中较快生长，用于发酵饲料时可有效规避杂菌污染，有益于饲料发酵。

图6 酵母菌耐酸曲线图Fig.6 Yeast acid tolerance curve

2.3.4 耐胆盐测定 由图7可知，JZ5和JZ8菌株在胆盐浓度超过0.2%时OD值变化小于0.3，菌株的生长受到严重抑制，胆盐浓度超过0.6%时基本停滞生长；JZ6和JZ9菌株在胆盐浓度超过0.6%时OD值变化小于0.5，菌株的生长受到较强的抑制作用，胆盐浓度超过2.0%时生长缓慢；JZ4和JZ10菌株在胆盐浓度超过2.0%时OD值变化0.5左右，菌株的生长受到较弱的抑制作用；MN24、MN25和MN29菌株在胆盐浓度超过1.0%时基本停滞生长。胆盐对9株酵母菌的生长均有抑制作用。

图7 酵母菌耐胆盐曲线图Fig.7 Yeast bile salt tolerance curve

2.3.5 药敏性测定 对上述筛选的9株酵母菌进行四环素、环丙沙星、妥布霉素、氯霉素、青霉素等12种常用药物的药敏性试验。由表3可知，JZ10菌株对四环素和青霉素呈中度敏感，对环丙沙星、妥布霉素、氯霉素和红霉素呈高度敏感；JZ8菌株对青霉素呈中度敏感，对红霉素呈高度敏感；其它菌株对12种常用药物均耐受。

表3 酵母菌药物敏感性结果Table 3 Results of yeast drug sensitivity

2.3.6 抑菌性测定 对上述筛选的9株酵母菌进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌性试验。由表4可以看出，JZ4、JZ5、JZ6、JZ8、JZ9和JZ10菌株均对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有抑制作用，对大肠杆菌无抑制作用；而MN24、MN25和MN29菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用，对沙门氏菌无抑制作用。其中，JZ4、JZ9和JZ10菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于20 mm，具有很强的抑菌性能；JZ5、JZ6、JZ8、MN24、MN25和MN29菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在10～20 mm，具有较强的抑菌性能；JZ4、JZ5、JZ6、JZ8、JZ9和JZ10菌株对沙门氏菌的抑菌圈直径均在10～20 mm，具有较强的抑菌性能；MN24和MN25菌株对大肠杆菌的抑菌圈直径均在10～20 mm，具有较强的抑菌性能，而MN29菌株对大肠杆菌的抑菌圈直径大于20 mm，具有很强的抑菌性能。

表4 酵母菌的抑菌结果Table 4 Antibacterial result of yeast

3 讨 论

酵母菌的生长性能和产酸性能是衡量酵母菌的重要衡量指标。酵母菌的生长分为迟缓期、对数期和稳定期[9]。迟缓期为菌株适应阶段，对数期为快速发酵阶段，稳定期为发酵完成阶段，此时酵母菌数量达到最高水平[10]。酵母菌的生长特性与菌种密切相关，快速的起酵速度可缩短生产周期，节省生产成本，提高经济效益，因此，筛选在最短时间达到快速生长期的菌株在饲料发酵行业有重要意义。在菌株生长过程中，延滞期越短，说明菌株环境适应性越强，生命力越旺盛[11]。本试验结果表明，毕赤酵母菌JZ10和马克斯克鲁维酵母菌MN24、MN25和MN29菌株起酵时间短，适应性强；而酿酒酵母菌JZ5和JZ8发酵完成时间最短且发酵活性较强，具有良好的发酵优势。酵母菌在生长过程中会产酸，降低所生长环境的pH，监控酵母菌在发酵过程中所处环境的pH变化，可为其在发酵饲料行业的应用提供依据。酵母菌在pH 3.8～6.5的范围内正常生长[12]，试验结果表明，这9株试验酵母菌生长发酵72 h后pH≥5.0，均能在各自产酸环境中正常生长。

酵母菌的耐酸和耐胆盐性能是酵母菌益生性的重要衡量指标。酸性环境可抑制有害菌生长，筛选出耐酸性强的酵母菌对益生菌制剂的研制有重要意义[13]。益生性菌株在被动物摄入后若要发挥其益生性作用，就要耐受动物胃液的强酸和小肠内的高浓度胆盐[14]。研究表明，高浓度胆盐通过疏水作用解离膜蛋白，使膜破裂从而导致益生菌失去生物活性，无法在动物胃肠道发挥益生作用[15]。动物小肠的胆盐浓度约在0.03%～0.3%，益生菌在此范围内能正常生长是其在动物胃肠道发挥益生作用的衡量标准[16]。因此，耐胆盐也是益生菌筛选中的重要衡量指标。酵母菌耐酸试验中酿酒酵母菌JZ9和毕赤酵母菌JZ10耐酸性最强，可在低酸环境正常生长，用于发酵饲料时可有效规避杂菌污染，有益于饲料发酵。耐胆盐试验中毕赤酵母菌JZ4和JZ10以及酿酒酵母菌JZ6和JZ9耐受2%浓度的胆盐，可在动物胃肠道发挥益生性作用。

益生菌对抗生素的敏感性和对病原菌的抑制性是益生菌体外安全实验的重要评价指标。动物摄入有耐药性的益生菌后可能会产生对抗生素的耐药性，动物机体内的其他菌株也可能会受到所饲喂益生菌耐药性的有害诱导，导致治疗难度加大[17]。目前对益生性酵母菌的筛选指标主要有蛋白含量、发酵速度、活菌数量等，从酵母菌抑菌性进行筛选的文献较少[18]。有研究发现从发酵乳中筛出的酵母菌对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用[19]，也有研究发现从马奶酒中筛出的酵母菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特氏菌有抑菌作用[20]。因此，无耐药性和强抑菌性是筛选益生菌的重要衡量指标。该试验中，毕赤酵母菌JZ10有广泛的药物敏感性且对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有强抑制作用，可作为抑制病原菌的安全性优势菌株应用于畜牧业。

4 结 论

本试验从从青海牦牛瘤胃中筛选到马克斯克鲁维酵母菌3株，从西藏青稞酒糟中筛选到酿酒酵母菌4株，毕赤酵母菌2株。其中，毕赤酵母菌JZ10相比于其它菌株起酵时间短，环境适应性强，有广泛的药物敏感性且对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有强抑制作用，具有良好的生长特性和益生特性，可用于益生菌制剂的制备。