3种不同羽色鸡MC1R基因SNPs鉴定及羽色相关性分析

赵浩名，孙志阳，路宏朝，王 令，王珊珊，张 涛

(陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)

羽色是鸡外观差异最大的性状之一，也是区分不同鸡品种的主要特征，不同地方鸡品种都有其独特的羽色，羽色对人民群众的消费观念有一定影响。略阳乌鸡产于陕西省汉中市略阳县黑河流域，为陕西优良地方品种，被列入《陕西省畜禽遗传资源保护名录》，是陕西省唯一的家禽保护品种，2009年被列为国家地理标志产品[1]。略阳乌鸡具有乌皮、乌喙、乌腿、乌趾、乌舌、乌冠“六端乌”典型特征，肉质优良，羽色多样，有黑、麻、白三种类型[2]。目前，略阳乌鸡的选育以黑羽性状为主，青脚麻鸡肉质细嫩、营养价值高，爪为青色，羽毛为棕褐色，适应性强、生长快、是目前广泛养殖的肉鸡品种[3]。丝羽乌鸡又名泰和乌鸡，羽毛为白色丝状，是驰名中外的乌鸡品种[4]。在家禽遗传育种实践中，羽色一直是一个主要的选育指标，其与消费者的喜好密切相关，具有重要的经济价值，但禽类羽色的生物学机制比较复杂，许多学者都对禽类羽色形成的遗传机制进行了研究。目前关于禽类羽色和哺乳动物毛色研究的报道都与黑素皮质素受体1(MC1R)基因的多态性和表达量有关[5]。

MC1R属于黑素皮质素受体(MCR)家族，是GTP结合蛋白偶联受体(GPCRs)中最小的成员[6]，在色素沉积中起到关键作用[7]，被确定为黑色素合成和分布的主要决定因素。MC1R由黑色素扩散位点(E)编码，E位点参与控制黑色素的合成和分布，影响皮肤和毛发的颜色[8]。MC1R与α促黑色素细胞激素(α-MSH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)结合，促进cAMP和酪氨酸酶的表达，使黑色素含量增加[9]。MC1R也参与多种病理生理过程，是黑色素瘤易感基因，其变异会导致细胞周期依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)突变，从而增加患黑色素瘤的风险[10]。MC1R作为控制毛色和羽色关键候选基因，其在哺乳动物中已做了较为系统的研究，但是禽类的羽色性状比哺乳动物更为复杂，不同品种及同一品种不同群体之间也存在较大差异[11]。因此，在不同家禽品种或者同一品种不同羽色群体之间研究MC1R基因多态性与羽色中的相关性研究，鉴定出不同类型的SNP对于家禽羽色性状遗传机制解析和遗传育种都具有重要意义。

本研究以略阳乌鸡(黑羽)、青脚麻鸡(麻羽)和丝羽乌鸡(白羽)为试验材料，比对分析不同品种MC1R基因编码区DNA序列和氨基酸序列，进行SNP和羽色相关性分析，以期获得与羽色密切相关的SNP位点，进一步丰富MC1R基因在禽类羽色研究中的分子遗传学数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

略阳黑羽乌鸡30只购自略阳县陕西同辉农业发展有限公司，青脚麻鸡和丝羽乌鸡各20只，购自陕西省城固县龙西养殖孵化场。

1.2 DNA提取

取鸡肝脏组织，基因组DNA提取按照文献[12]的操作流程进行，溶于超纯水，-80 ℃长期保存。

1.3 引物序列

根据NCBI上的红原鸡MC1R基因序列(GenBank登录号为AB201630)，应用Primer 5.0软件设计PCR引物，引物序列为MC1R-F，5'-GGGCTTTGTAGGTGCTGCAGTTG-3'和MC1R-R，5'-CATCCATCCTCCTGTCTGTGCC-3'，由通用生物系统安徽有限公司合成。

1.4 PCR扩增与检测

PCR扩增体系：上、下游引物各2 μL，Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，加入dd H2O 补足至50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。取PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像仪上拍照。

1.5 测序与比对

PCR扩增产物送通用生物系统安徽有限公司测序，使用SECentral 7.01软件进行序列拼接。以红原鸡MC1R基因序列为参照，通过DNAMAN 5.0软件对略阳黑羽乌鸡、青脚麻鸡、丝羽乌鸡的MC1R基因序列进行比对分析。

1.6 蛋白理化参数分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对MC1R蛋白理化参数进行分析。

1.7 二级结构的预测

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对MC1R蛋白进行二级结构预测。

1.8 三级结构的预测

使用Swiss Model在线网站(https://swissmodel.expasy.org/)对MC1R蛋白进行三级结构预测。

1.9 统计分析

本研究根据SNPs位点定义不同基因型，在计算群体不同位点基因型频率和等位基因频率后，通过SPSS 20.0软件进行了MC1R基因SNP位点与羽色性状的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 MC1R基因的PCR扩增结果

从图1可以看出，每一个样品均扩增出大小位于1 000 bp以上的单一条带，PCR产物与目的片段预期大小(1 026 bp)一致，说明成功扩增出3个鸡种MC1R基因，且无非特异性扩增，能够直接用于后续测序分析。

图1 MC1R基因PCR产物凝胶电泳图M.DL-2000；1-10.PCR产物Fig.1 Gel electrophoresis map of PCR products of MC1R geneM.DL-2000；1-10.PCR products

2.2 三个鸡种MC1R基因测序与比对

以NCBI公布的红原鸡MC1R基因编码区为参照，通过SECentral 7.01软件对MC1R基因编码区测序结果进行序列拼接，发现3个鸡种该基因CDS区长度均为945 bp。采用DNAMAN 5.0软件对3个鸡种MC1R基因编码区进行序列比对(图2)，发现3个鸡种与红原鸡序列同源性均在99 %以上。3个鸡种群体中共检测到8个MC1R基因SNPs，分别为69(C/T)、212(T/C)、274(G/A)、398(T/C)、636(G/A)、637(T/C)、644(A/C)和834(C/T)，各位点碱基变异如图3所示。

图2 3个鸡种群与红原鸡MC1R基因序列比较Fig.2 Comparison of MC1R gene sequences between three chicken populations and Hongyuan chicken breed

图3 MC1R基因SNPs位点测序结果Fig.3 Results of SNPs site sequencing of MC1R gene

2.3 不同类型鸡MC1R氨基酸序列分析

将3个鸡种不同突变类型MC1R的氨基酸序列进行比对分析，发现本试验检测到的8个SNPs位点中有4个导致氨基酸序列发生变化，分别为212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)，各位点引起的氨基酸序列变异见表1。根据氨基酸序列的差异，本研究以红原鸡MC1R氨基酸序列为参考，将其定位为I型，在略阳黑羽乌鸡、青脚麻鸡和丝羽乌鸡发现了II型、III型、IV型和V型4种MC1R类型，各类型氨基酸序列比对结果如图4所示，且MC1R蛋白II型、III型、IV型、V型与I型的氨基酸序列相似度在97%～99%。以MC1R蛋白I型为参照，II型与I型相比有2处突变，分别为71(M/T)和213(C/R)；III型与I型相比有1处突变，为71(M/T)；IV型与I型相比有2处突变，分别为71(M/T)和215(H/P)；V型与I型相比有2处突变，分别为133(L/P)和213(C/R)。对不同类型MC1R蛋白类型进行统计分析，发现略阳黑羽乌鸡存在两种MC1R蛋白类型，而青脚麻鸡和丝羽乌鸡只有一种MC1R蛋白类型，见表2。

图4 不同类型MC1R蛋白氨基酸序列比较Fig.4 Comparison of amino acid sequences of different types of MC1R proteins

表1 MC1R基因SNPs与对应的氨基酸变化情况Table 1 Changes of MC1R gene SNPs and corresponding amino acids

2.4 不同类型MC1R蛋白的理化性质分析及蛋白质结构解析

由表3知，不同类型的MC1R蛋白理化性质存在一定差异，其中IV型不稳定系数最高，II型不稳定系数最低，I型、II型、III型和IV型脂肪系数相同，均高于V型，V型总平均疏水性最弱，I型最高。

类型Types71133213215备注NoteI型TypeIMetLeuCysHis红原鸡(100%)II型TypeIIThrLeuCysHis略阳乌鸡(50%)III型TypeIIIThrLeuArgHis略阳乌鸡(50%)IV型TypeIVThrLeuCysPro青脚麻鸡(100%)V型TypeVMetProArgHis丝羽乌鸡(100%)

表3 不同类型MC1R蛋白的理化性质分析Table 3 Analysis of physicochemical properties of different types of MC1R proteins

由图5可见，MC1R有7个高疏水性域、5个高亲水性域、7个跨膜结构与几个卷曲螺旋区域。分析发现I型α-螺旋占51.27%、β-折叠占2.55%、无规则卷曲占27.71%；II型α-螺旋占50.32 %、β-折叠占2.55%、无规则卷曲占29.94%；III型α-螺旋占52.55%、β-折叠占2.87%、无规则卷曲占26.43%；IV型α-螺旋占54.14 %、β-折叠占3.50%、无规则卷曲占25.16%；V型α-螺旋占56.05%、β-折叠占1.91%、无规则卷曲占26.43%。

图5 MC1R蛋白二级结构的预测结果注：蓝色，α-螺旋；红色，延伸链；Fig.5 Prediction of secondary structure of MC1R proteinNote:blue,α-helix;red,extended chain

使用Swiss Model软件对MC1R蛋白序列进行三级结构预测，模型覆盖了87%～92%的氨基酸，其中α-螺旋构成7个跨膜区(图6)。从三级结构分析发现I型、II型、III型、IV型和V型三维结构基本一致，不同类型间氨基酸序列的变异虽然导致部分区域发生较小变化，但没有导致MC1R蛋白结构的整体性改变，说明该蛋白结构保守，具有重要的生物学功能，其中一些变异位点可能影响其部分生物学活性，但不影响其基本生理功能。

图6 MC1R蛋白三级结构的预测结果Fig.6 Prediction of tertiary structure of MC1R protein

2.5 不同鸡种SNPs位点分布频率及羽色性状的关联分析

对造成氨基酸序列改变的4个SNPs在3个鸡种群体的分布频率和羽色相关性进行分析(表4)，发现212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)位点的基因频率在3个群体之间存在极显著差异(P<0.001)。其中，在212(C/T)位点和398(T/C)位点，略阳黑羽乌鸡和青脚麻鸡全部为C/C和T/T型；637(T/C)位点，略阳黑羽乌鸡存在3种基因型，青脚麻鸡只有T/T型，丝羽乌鸡只有C/C型；644(A/C)位点，略阳黑羽乌鸡和丝羽乌鸡全部为A/A型，青脚麻鸡全部为C/C型。通过基因型和羽色相关性分析，发现各SNPs均与羽色性状存在极显著相关性。

表4 MC1R基因SNPs位点分布频率与羽色关联性分析Table 4 Analysis of the relationship between SNPs locus distribution frequency of MC1R gene and feather color

3 讨 论

MC1R基因与黑色素形成、黑色素瘤及动物体内黑色素的沉积、迁移与分布密切相关[13]。本研究选择略阳黑羽乌鸡、青脚麻羽乌鸡和白色丝羽乌鸡3个羽色特征鲜明的品种为对象，研究MC1R基因在3个鸡种中的DNA序列变异，筛选与羽色性状密切相关的SNPs，以期获得有效的选育标记。

MC1R是黑素皮质素受体家族成员，其蛋白结构可以分为N末端和C末端，含有7个由α螺旋组成的跨膜结构域[14]。MC1R参与多种生理病理过程，在色素沉积中起关键作用，控制黑色素的合成和分布，影响动物皮肤和毛发的颜色[7]。MC1R基因突变可能会改变其活性，哺乳动物MC1R的基因型多态性与黑色素沉积差异有关[15]。Hirokazu等[16]对日本褐牛研究，发现MC1R基因c.871G>A位点突变导致日本褐牛毛色变异。陈多珍等[17]在狄高肉鸡MC1R基因编码区检测到8个SNP位点。Zhang等[18]研究发现，云南飘鸡MC1R基因的C69T、T212C和A274G位点与瓦灰色羽毛显著相关。Liu等[19]研究发现，非同义SNP 212T>C导致第71位氨基酸由蛋氨酸替换为苏氨酸，影响了鸡MC1R蛋白的生物学功能。在哺乳动物和鸟类细胞中，过表达的MC1R会导致黑色素合成增加，而低表达的MC1R则会导致黑色素合成不足[20]。目前认为MC1R通过促进cAMP表达，激活小眼畸形相关转录因子(MITF)使黑色素沉积[21]。

本研究在3个鸡种MC1R基因编码区检测到8个SNPs位点，4个SNPs引起氨基酸变化，分别是212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)，统计分析发现这4个SNPs位点均与鸡羽色极显著关联(P<0.001)。在略阳黑羽乌鸡和青脚麻鸡中发现的212(T/C)突变，该突变位点在赤水乌骨鸡和兴义白鸡中也存在[22]。丝羽乌鸡中发现的398(T/C)位点突变在广元灰鸡则是398(T/A)突变[23]。略阳黑羽乌鸡和丝羽乌鸡的637(T/C)在贵州黄快、慢羽鸡、兴义白鸡和罗曼蛋鸡中也有发现[24]。青脚麻鸡的644(A/C)突变在兴义白鸡中也有发现[24]。基于SNPs导致的氨基酸序列变异，本研究以红原鸡MC1R序列为参考，定义了II型、III型、IV型与V型4种MC1R蛋白类型，并进行了蛋白质理化性质和机构分析，发现不同类型的MC1R的稳定性、疏水性和脂肪系数存在一定差异，二级结构略有变化，但是蛋白质整体三级结构影响不大，只是部分区域发生较小改变，说明该蛋白具保守的生物学功能，一些位点的变异可能影响部分生物学功能，但对其基本生理功能没有改变。

本研究通过对羽色特征差异明显的3个鸡种MC1R基因序列分析，共检测到8个SNPs，其中4个SNPs位点引起氨基酸序列变异，对MC1R蛋白质的性质和结构产生一定改变，可能影响了蛋白质的功能。各变异位点与羽色相关分析显示呈现出显著性，该研究结果进一步丰富了对MC1R在禽类黑色素沉积和分布研究中的数据，同时为鸡品种遗传资源评价、保护和选育提供了理论支撑，建议将其作为鸡羽色选育的参考分子标记。