沉默MyD88抑制NF-κB p65活化对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡和炎症损伤的保护作用

王成，金卫东，郭长磊，李霞，刘振，韩明磊，侯永兰，崔佳佳

(1.新乡市中心医院 心血管内一科，新乡 453000；2.新乡医学院第一附属医院 心血管内科，新乡 453000)

心血管系统疾病，如心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉微栓塞等常常伴有心肌组织炎症反应，严重威胁着人们的健康及生命。TNF-α是机体内关键的炎性因子，促进心力衰竭、动脉粥样硬化等心血管系统疾病的发生发展，诱导心肌细胞损伤[1]。具体而言，心肌组织中高水平的TNF-α可诱导心肌细胞损伤，促进细胞凋亡，破坏心肌组织结构[2]。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)可激活NF-κB，引起其高表达，释放一系列炎症介质，破坏心脏局部免疫平衡，最终引起炎性因子的大量释放，触发炎症反应，致使心肌细胞凋亡等[3]。已有研究表明，MyD88 敲除小鼠在肾脏和心肌缺血再灌注过程中由炎症反应导致的组织损伤和脏器功能紊乱明显减轻[4]，沉默MyD88可抑制IEC-6细胞凋亡改善肠道炎症性疾病病情[5]，故推测沉默MyD88表达可有效改善心肌炎症。目前还没有有关沉默MyD88对TNF-α诱导的心肌细胞炎症反应相关研究，本研究以此为切入点探究沉默MyD88抑制NF-κB p65活化对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡和炎症损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂DMEM培养液、青-链霉素、FBS和胰蛋白酶，购自Gibco公司；shRNA-MyD88慢病毒及对照慢病毒shRNA-NC，购自上海吉玛制药技术有限公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)细胞增殖检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自碧云天生物技术研究所；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB，CK-MB)测试盒、肌红蛋白(myohemoglobin，Mb)测试盒、肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)测试盒、IL-1β测试盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)分型测试盒、IL-6测试盒和IL-10测试盒，购自南京建成生物工程研究所；兔抗人MyD88、Ki67、Bax、Bcl-2、c-Myc、NF-κB p65单克隆抗体，购自Abcam公司。

1.2 实验细胞人H9C2细胞，购自美国菌种保藏中心。将H9C2细胞培养于含10% FBS和1 %青-链霉素的高糖DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。每隔3 d更换1次培养液，实验时用0.25%胰蛋白酶消化收集对数生长期细胞。

1.3 细胞的处理与分组[6]接种对数生长期的H9C2细胞于24孔板，细胞铺底率为50%时用含10% FBS的DMEM稀释shRNA-MyD88慢病毒和对照慢病毒，加至24孔板。于培养孔内添加5 μg/mL的聚凝胺，混匀培养12 h后更换细胞培养液，继续培养3 d后用嘌呤霉素筛选10 d，即得到稳定感染的细胞株。将细胞随机分为4组：取稳定感染shRNA-MyD88慢病毒的H9C2细胞，用含20 μg/L TNF-α的细胞培养液培养24 h，记为TNF-α+sh-MyD88组；用含20 μg/L TNF-α的细胞培养液培养稳定感染对照慢病毒的H9C2细胞24 h，记为TNF-α+shRNA-NC组；用含20 μg/L TNF-α的细胞培养液培养未感染的H9C2细胞24 h，记为TNF-α组；以不受任何处理的H9C2细胞为Control组。

1.4 Western blotting检测各组细胞MyD88及NF-κB信号通路蛋白表达水平用PBS漂洗各组细胞3次，再加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白质水平。提取等量的蛋白样本(20 mg)，100 ℃变性5 min。SDS-PAGE分离蛋白并转移至PVDF膜，5% BSA室温封闭1～2 h后加入相应的一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育。次日，向PBS漂洗后样本中加入抗IgG-HRP二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，漂洗。最后加入化学发光液后，于凝胶成像仪曝光摄片，并用ImageJ软件统计灰度值计算蛋白的相对表达量。实验以GAPDH为参照蛋白，操作至少独立重复3次。

1.5 ELISA检测各组细胞上清液心肌损伤因子和细胞因子水平将H9C2细胞按3×105个/mL、100 μL/孔体积加至96孔酶标板，按1.3方法分组。收集各组细胞培养上清液，按ELISA试剂盒说明书检测CK-MB、Mb、cTnⅠ、IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平，用酶标仪测定光密度D(450 nm)值。

1.6 FACS检测各组心肌细胞凋亡情况收集心肌细胞悬液至10 mL离心管中，每份样本的细胞密度为3×106个/mL(2 mL/孔)，800×g离心5 min；弃去培养液，用孵育缓冲液漂洗1次，800×g离心5 min；用100 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬细胞，室温条件下避光孵育10～15 min，800×g离心5 min；用孵育缓冲液漂洗细胞沉淀1次，加入荧光溶液(SA-FLOUS)4 ℃条件下孵育20 min，避光反应并持续摇晃反应液，FCM检测并通过CytExpert软件分析检测结果。

1.7 BrdU染色检测各组心肌细胞增殖情况将转染后的细胞传代接种于6孔板，待细胞铺底率达80%时，用含0.4% FBS的培养液孵育72 h；加入终浓度为0.03 μg/mL的BrdU继续孵育40 min，PBS漂洗细胞3次，多聚甲醛固定10 min；严格按照说明书操作检测心肌细胞增殖能力，镜下观察并计数BrdU染色阳性细胞数。

1.8 RT-PCR检测心肌细胞增殖、凋亡相关基因mRNA水平TRIzol法提取H9C2细胞总RNA，用NanoDrop分光光度计测定光密度[D(260 nm)/D(280 nm)]比值。按照试剂盒说明书合成cDNA并完成PCR扩增，反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共扩增35个循环；72 ℃延长10 min。于4 ℃条件下保存反应产物，通过2%琼脂糖凝胶电泳分离目标蛋白。

2 结果

2.1 沉默MyD88表达下调TNF-α诱导的心肌细胞MyD88蛋白表达水平Western blotting检测各组细胞MyD88蛋白表达水平。结果显示，与Control组相比，TNF-α组MyD88蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组MyD88蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。(图1)

注：1. Control组；2. TNF-α组；3. TNF-α+shRNA-NC组；4. TNF-α+sh-MyD88组。与Control组相比，*P<0.05；与TNF-α+shRNA-NC组相比，#P<0.05。图1 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞MyD88蛋白表达水平的影响

2.2 沉默MyD88表达降低TNF-α诱导的心肌细胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平ELISA检测各组细胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平。结果显示，与Control组相比，TNF-α组CK-MB、Mb、cTnⅠ含量显著升高(P<0.05); 与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组CK-MB、Mb及cTnⅠ含量显著降低(P<0.05)。(表1)

表1 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞CK-MB、Mb及cTnⅠ水平的影响

2.3 沉默MyD88表达抑制TNF-α诱导的心肌细胞凋亡FACS检测各组心肌细胞凋亡情况。结果显示，与Control组相比，TNF-α组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。(图2)

注：A. FACS检测心肌细胞凋亡情况；B. 各组心肌细胞凋亡率直方图。1. Control组；2. TNF-α组；3. TNF-α+shRNA-NC组；4. TNF-α+sh-MyD88组。与Control组相比，*P<0.05；与TNF-α+shRNA-NC组相比，#P<0.05。图2 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡的影响

2.4 沉默MyD88表达促进TNF-α诱导的心肌细胞增殖BrdU染色检测各组心肌细胞增殖情况。结果显示，与Control组相比，TNF-α组BrdU染色阳性细胞数显著减少(P<0.05)；与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组BrdU染色阳性细胞数显著增加(P<0.05)。(图3)

注：A. BrdU染色检测心肌细胞增殖情况(×200)；B. 各组BrdU染色阳性细胞数直方图。1. Control组；2. TNF-α组；3. TNF-α+shRNA-NC组；4. TNF-α+sh-MyD88组。与Control组相比，*P<0.05；与TNF-α+shRNA-NC组相比，#P<0.05。图3 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞增殖的影响

2.5 沉默MyD88表达增加TNF-α诱导的心肌细胞Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2mRNA/BaxmRNA比值通过RT-PCR检测各组细胞Ki67、Bcl-2、Bax、c-MycmRNA水平。结果显示，与Control组相比，TNF-α组Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值显著降低(均P<0.05); 与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值显著升高(均P<0.05)。(表2)

表2 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞Ki67、c-Myc mRNA水平和Bcl-2mRNA/Bax mRNA比值的影响

2.6 沉默MyD88表达降低TNF-α诱导的心肌细胞IL-1β、iNOS和IL-6水平，增加IL-10水平通过ELISA检测各组细胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10含量。结果显示，与Control组相比，TNF-α组IL-1β、iNOS、IL-6含量显著升高(均P<0.05)； 与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组IL-1β、iNOS、IL-6含量显著降低(P<0.05)，IL-10含量显著升高(P>0.05)。(表3)

表3 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平的影响

2.7 沉默MyD88表达降低TNF-α诱导的心肌细胞NF-κB p-p65/p65水平Western blotting检测各组细胞NF-κB p65磷酸化水平。结果显示，与Control组相比，TNF-α组p-p65/p65比值显著升高(P<0.05)；与TNF-α+shRNA-NC组相比，TNF-α+sh-MyD88组p-p65/p65比值显著降低(P<0.05)。(图4)

注：1. Control组；2. TNF-α组；3. TNF-α+shRNA-NC组；4. TNF-α+sh-MyD88组。与Control组相比，*P<0.05；与TNF-α+shRNA-NC组相比，#P<0.05。图4 沉默MyD88表达对TNF-α诱导的心肌细胞p-p65/p65比值的影响

3 讨论

MyD88作为TLR4的主要胞内接头蛋白，在TLR4激活引起的炎症反应中发挥关键作用。TLR介导的心肌炎症反应可使心肌遭受严重损伤[7]，故推测沉默MyD88表达可有效改善心肌炎症。相关研究表明，MyD88敲除小鼠在肾脏和心肌缺血再灌注过程中能够减少炎症反应导致的组织损伤和功能紊乱[8]。同时，沉默MyD88可抑制IEC-6细胞凋亡，改善肠道炎症性疾病[5]。本研究结果表明，TNF-α诱导炎症性心肌细胞MyD88表达水平升高。

在心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、动脉粥样硬化等疾病发生过程中常常伴随有炎症反应。心肌细胞受到氧化应激刺激后，细胞分泌炎性因子，而过量的炎性因子可引起正常细胞的损伤，从而导致心功能障碍[9]。TNF-α是一种心肌炎症损伤诱导因子，其可诱导正常心肌细胞凋亡，降低细胞增殖活性，诱导心肌炎症损伤。IL-10是抑炎因子，可通过抑制NF-κB表达减少TNF-α等炎性因子的释放，其表达量越高，组织炎症性损伤情况越改善[10]。本研究发现，TNF-α处理后的H9C2心肌细胞IL-1β、iNOS、IL-6、IL-10水平升高，而沉默MyD88表达则逆转促炎因子的释放。

CK-MB、Mb、cTnⅠ是常见的心肌损伤标志物，在心肌损伤时会大量释放，其含量高低用于评估心肌细胞的活力及状态[11]。本研究发现，沉默MyD88表达可降低TNF-α诱导的心肌细胞CK-MB、Mb、cTnⅠ水平，提示沉默MyD88表达可改善心肌损伤。

细胞凋亡也称细胞程序性死亡，当心肌细胞发生炎症反应时，细胞在基因水平上失去对其生长和凋亡的正常调控，凋亡程序发生紊乱，导致细胞异常凋亡[12]。细胞凋亡这一过程涉及凋亡诱导因子和凋亡抑制因子等调节因子。其中，抗细胞凋亡成员Bcl-2可防止细胞凋亡，而促凋亡成员Bax位于线粒体外膜或细胞质，并在应激状态下寡聚化，促进线粒体释放促凋亡因子，从而引发细胞凋亡[13]。Bcl-2/Bax作为检测细胞凋亡的常用指标，其比值增加意味着凋亡被抑制，这预示着损伤心肌可得到恢复。本研究发现，沉默MyD88表达具有抑制TNF-α诱导的心肌细胞凋亡，升高Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值，提示沉默MyD88表达通过抑制细胞凋亡改善心肌损伤。

心肌炎时，心肌细胞的增殖活性会降低。Ki67是一种细胞增殖抗原，可作为细胞增殖活性评估的重要指标之一，目前在包括心肌细胞等的研究中被广泛应用[14]。c-Myc是一种原癌基因，与细胞增殖周期有关，是细胞的转录促进因子，能促进细胞从G0/G1期进入S期[15]。当生长因子充足时，c-Myc对细胞的增殖分裂具有一定的促进作用，可有效抑制细胞凋亡；在生长因子不足的情况下，c-Myc则会抑制细胞分裂增殖及凋亡[16]。Cao等[17]研究发现，艾塞那肽通过抑制TNF-α诱导的细胞凋亡保护心肌细胞。本研究发现，沉默MyD88表达具有促进TNF-α诱导的心肌炎心肌细胞增殖，升高Ki67、c-MycmRNA水平的作用，提示沉默MyD88表达通过促进细胞增殖修复心肌损伤。

TLR/MyD88/NF-κB信号通路是机体炎症体系中的重要通路，其广泛存在于各种组织细胞中，在多种疾病发病及治疗过程中发挥重要作用[18]。NF-κB是调控许多促炎基因表达的主要转录因子，在细胞炎症进程中发挥重要作用[19]。NF-κB存在于细胞质中，以异源二聚体的形式存在， 主要由p65和p50组成。TLR2、4可通过MyD88途径将刺激信号转导入细胞内，产生级联信号，导致NF-κB活化，从而启动多种与炎症反应相关的基因转录[20]。Xu等[21]研究发现，NF-κB p65表达上调可诱导炎症的发生，在心肌组织炎症中表达上调。张红利等[22]研究发现，参芍口服液通过抑制TLR4/MyD88依赖性信号通路抑制NF-κB的表达，继而抑制炎症级联反应，从而达到保护心脏结构及功能的作用。本研究发现，沉默MyD88表达具有降低p-p65/p65比值的作用，提示其可通过抑制NF-κB p65磷酸化改善心肌细胞损伤。

综上所述，沉默MyD88可促进TNF-α作用下心肌细胞增殖，抑制其凋亡并抑制炎性因子释放。这可能是通过抑制NF-κB p65的活化实现的。本研究只在单一细胞株中进行初步研究，下一步计划在原代心肌细胞及体内进行多方面的验证和分析。