T细胞与肿瘤细胞共培养方法及其应用进展

赵庆敏，刘永琦，李佳蔚，李玲，李程豪，李研

(1.甘肃中医药大学 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，兰州 730000；2. 湖北省武汉市武昌区积玉桥街社区卫生服务中心，武汉 430000；3.甘肃中医药大学 敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，兰州 730000)

肿瘤微环境的组成除了肿瘤细胞外，还有大量免疫细胞、基质细胞和各种可溶性因子，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞与免疫细胞相互影响，前者通过各种信号转导途径调节微环境中免疫细胞的组分及细胞因子的分泌，构建适合自身生长的微环境。而T细胞作为肿瘤微环境中主要的免疫细胞，在肿瘤发展和临床治疗的各个阶段发挥重要作用，是介导肿瘤适应性免疫的重要组成部分，在抗肿瘤免疫中发挥关键作用[1]。T细胞分类方式多样，成熟T细胞可分为CD4+和CD8+T细胞，CD4+T细胞也被称为Th，通过MHC Ⅰ类分子与抗原直接结合；CD8+T细胞也被称为CTL，通过MHC Ⅱ类分子与抗原直接结合，在肿瘤免疫中发挥不同作用。T细胞和肿瘤细胞体外共培养存在一定难度，各种培养方法缺乏统一性，也无共培养相关资料可参考。文章主要对CD4+和CD8+T细胞与肿瘤细胞共培养的应用进行归纳，也对其他淋巴细胞，如PBMC、CD3+T细胞和人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)Jurkat T细胞与肿瘤细胞共培养的方法进行了简单总结，旨在为免疫治疗和免疫机制的研究提供参考。

1 CD4+T细胞-肿瘤细胞共培养系统

1.1 肿瘤细胞对CD4+T细胞的影响免疫微环境是多种细胞或因子参与的复杂环境，T细胞与肿瘤细胞可以产生大量细胞因子，肿瘤细胞可以产生细胞因子影响T细胞的分化类型，在免疫微环境中发挥作用。例如，原发性胃癌细胞和胃癌细胞系都可诱导T细胞发生转化。Lu等[2]首先证实胃癌患者肿瘤部位Treg数量庞大，将CD4+T细胞与原发性胃癌细胞以1∶2比例在Transwell小室培养5 d，结果证明原发性胃癌细胞可通过TGF-β1诱导初始T细胞向Treg转化。Yuan等[3]也做了类似研究，但使用CD4+T细胞与胃癌细胞上清液共培养，也发现胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901)通过TGF-β1诱导CD4+CD25-初始T细胞向Treg转化。实验中CD4+T细胞与肿瘤细胞共培养后发现肿瘤细胞可分泌细胞因子影响Treg的产生，并在胃癌微环境中发挥作用。

1.2 Treg对肿瘤细胞的影响Treg占CD4+T细胞的一小部分，是适应性免疫反应的调节细胞，在维持自身抗原耐受中起重要作用，也提供了与肿瘤微环境相关的抑制作用。Foxp3是Treg的标志性分子之一，对Treg的发育及功能发挥起关键作用[4-5]。Peng等[6]发现，Treg与非小细胞肺癌细胞共培养后，微环境中Foxp3水平的增加可能促进肿瘤细胞的生长，将健康人Treg与非小细胞肺癌细胞 95D以2∶1比例于Transwell小室共培养14 d后发现，Treg中Foxp3表达量显著增加，95D细胞中的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表达量上调，且95D细胞活力和侵袭能力增强，肿瘤生长得到促进。Treg作为重要的免疫细胞类型，有关其标志性分子Foxp3在微环境中发挥作用的机制还有待探讨。刘瑞敏等[7]将健康人CD4+T细胞与稳定转染高表达Foxp3的肺癌细胞株(NCIH-hFoxp3细胞)以1∶1比例于Transwell小室共培养72 h，发现活化CD4+T细胞的增殖水平和活性降低，高表达Foxp3的肿瘤细胞可能通过这种方式逃避机体免疫监视，和Treg的调节作用相似。研究将Treg和肿瘤细胞共培养，以及CD4+T细胞与高表达Treg标志性分子的肿瘤细胞共培养，共同探讨了Treg及其标志性分子Foxp3在肺癌微环境中的作用及机制。

1.3 靶点抑制剂对Treg和肿瘤细胞的影响组织蛋白酶S(cathepsin S，CatS)是一种在多种疾病过程中发挥重要作用的半胱氨酸蛋白酶，尤其与肿瘤的关系是近年来研究的热点。Yan等[8]发现CatS抑制剂具有降低 Treg免疫抑制活性的作用，进一步的研究揭示了CatS抑制剂在肿瘤细胞存在时对T细胞的影响：将CatS抑制剂处理的Treg与鼠膀胱癌细胞MB49或脾脏细胞以1∶1比例共培养24 h，与PBS处理的Treg相比，抑制剂处理的Treg与肿瘤细胞共培养后，Treg增殖减少，凋亡增多；抑制剂处理的Treg与脾脏细胞共培养后，B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖水平明显降低；但在脾脏细胞中加入肿瘤细胞条件培养液后，B细胞和CD4+T细胞增殖能力变化不显著，但CD8+T细胞增殖增多，凋亡减少。以上表明CatS抑制剂在正常条件下抑制Treg并降低总体T细胞免疫，在肿瘤细胞存在条件下增强了CD8+T细胞免疫。研究将Treg和肿瘤细胞共培养，探讨靶点抑制剂对Treg和膀胱癌细胞的影响，也揭示其影响膀胱癌微环境中免疫功能的可能机制。

1.4 其他免疫细胞对CD4+T细胞和肿瘤细胞的影响免疫微环境是多种细胞或因子等参与的复杂环境，淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell，LEC)是淋巴管内皮的主要成分，在宿主固有免疫应答的启动中发挥重要作用。LEC不仅可以发挥抗原提呈作用，还分泌促炎细胞因子和趋化因子以调节免疫应答[9-10]。Tokumoto 等[11]将分选的CD4+T细胞、胃癌患者来源的LEC和胃癌细胞OCUM12以1∶3∶30比例共培养3 d，观察到在肿瘤细胞诱导的炎症条件下，LEC与CD4+T细胞相互作用，抑制后者产生细胞因子，从而抑制T细胞免疫应答。将CD4+T细胞、LEC和肿瘤细胞共培养为探讨其他类型免疫细胞对T细胞和肿瘤细胞的影响及可能机制提供了参考。

1.5 免疫检查点对CD4+T细胞的影响近年来免疫检查点再次受到研究者的关注，其对于很多肿瘤，尤其是恶性且化疗耐受的肿瘤患者有着显著效果。PD-1和CTLA-4在调节T细胞免疫反应中发挥重要作用，但部分患者不能从中获益。T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin mucin 3， TIM-3)以及淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)分子是热门的免疫检查点分子，虽属同一类共抑制受体，但其发挥功能的机制并不相同。Ozkazanc等[12]将CD4+T细胞与5种不同髓系白血病细胞分别以1∶0.25、1∶2和1∶4比例共培养96 h，不同比例和时间条件下TIM-3和LAG3受体变化趋势不同，但持续共刺激96 h后，CD4+T细胞表面PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG3的表达均上调，除了T细胞活化抗体的影响，白血病细胞信号在其中不仅刺激了T细胞反应，而且诱导了共抑制受体的表达。实验将CD4+T细胞与肿瘤细胞共培养研究了T细胞共抑制受体对T细胞及相关因子的影响，也为阐明共抑制信号对T细胞影响机制提供了帮助。

1.6 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞过继免疫疗法的应用近年来肿瘤免疫治疗方法之一的过继性免疫治疗成为热门，其以多种形式通过调节自身免疫系统以治疗肿瘤，例如CAR-T细胞治疗即CAR-T疗法，通过对T细胞进行修饰，体外扩增后回输至患者体内，改造T细胞获得特异性识别肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞过继免疫疗法也在外周T细胞淋巴瘤中发挥作用，扩展了肿瘤患者的治疗可能。例如，Pinz等[13]转染了来自CD4+T细胞的CAR-T细胞与表达CD4的间变性大细胞淋巴瘤KARPAS 299细胞，分别以2∶1、 5∶1和10∶1比例共培养24 h。CD4+CAR-T细胞在扩增后产生大量CD8+T细胞并清除了肿瘤细胞，表明其在CD4+的间变性大细胞淋巴瘤细胞中有效，可用作移植或独立治疗外周T细胞淋巴瘤。实验将CD4+CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养，发现淋巴瘤细胞明显减少，这扩展了外周T细胞淋巴瘤的治疗范围，为有效的临床治疗提供了可能。

2 CD8+T细胞-肿瘤细胞共培养系统

2.1 趋化因子对肿瘤细胞和CD8+T细胞的影响肿瘤微环境中存在大量各种类型的趋化因子，趋化因子是细胞迁移和细胞间相互作用的必不可少的调节因子，了解趋化因子与肿瘤细胞之间的相互影响以及它们对免疫反应和肿瘤转移的影响，对肿瘤的发展至关重要[14]。Sugasawa等[15]将PBMC、CD4+T细胞、CD4-T细胞或CD8+T细胞与胃癌细胞以2∶1比例共培养48 h，发现CD4+T细胞产生大量趋化因子配体5(C-C chemokine ligand 5，CCL5)促进胃癌细胞(MKN45、KATOⅢ)增殖，CCL5处理的胃癌细胞通过Fas/FasL途径诱导CD8+T细胞凋亡，证明胃癌细胞可通过诱导CCL5的表达获得增殖及病情进展。此研究方法中T细胞与肿瘤细胞的共培养为研究趋化因子在胃癌微环境中的影响提供了合适模型，也为了解胃癌发展机制提供了基础。

2.2 免疫检查点对CD8+T细胞的影响免疫检查点被证明在多种肿瘤中效果显著。PD-1和CTLA-4是目前研究最多的检查点分子，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达免疫检查点配体PD-L1与T细胞表面的PD-1结合介导肿瘤免疫逃逸。针对其途径的抑制能够有效解除T细胞的抑制状态，对肿瘤细胞进行杀伤。Huang等[16]将健康供体来源的CTL与过表达PD-L1的肝细胞癌细胞以10∶1比例共培养48 h，发现CD8+CTL通过HLAⅠ类分子显著上调肝癌细胞(Bel7402、HepG2)PD-L1的表达，其过表达又影响CD8+CTL中IFN-γ的分泌，表明PD-L1表达与CD8+CTL体外抗肿瘤反应有关。免疫检查点PD-1除了配体PD-L1，还有另一个配体PD-L2，其在调节T细胞功能中发挥重要作用。Leng 等[17]将CD8+T细胞与转染的过表达PD-L1和PD-L2的人食管癌细胞Ec109以5∶1比例培养48 h，发现PD-L1组CD8+T细胞增殖，PD-L2组CD8+T细胞减少，阻断信号通路都可以抑制其作用。以上表明PD-L1和PD-L2发挥的免疫作用可能不同，但有关PD-L2的研究较少，PD-L2可能还有除PD-1外的其他受体[18]，其确切作用和分子机制还需进一步研究。该模型的建立也为阐明免疫检查点其他配体的作用和可能机制提供了基础。

除了最常见的免疫检查点分子PD-1外，还有一些新型的免疫检查点在肿瘤中也发挥重要作用。T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是一种抑制T细胞反应的免疫检查点分子，它与配体CD155以高亲和力结合并与配体CD112低亲和力结合，在体内CD226与它竞争结合2个配体，是复杂配受体网络的一部分[19]。He等[20]将健康人来源的CD8+T细胞和CD8+TIGIT+T细胞与胃癌细胞SGC7901以5∶1比例共培养，证明胃癌细胞可以诱导CD8+T细胞表面TIGIT表达。TIGIT与肿瘤细胞表达的配体CD155结合抑制CD8+T细胞代谢和效应功能，这些作用可以被葡萄糖或TIGIT阻断中和，支持CD155/TIGIT可作为胃癌潜在的治疗靶点。表达TIGIT的CD8+T细胞与肿瘤细胞的共培养为阐明肿瘤微环境中TIGIT及其配体的作用机制提供了参考，也为胃癌提供了更多可能的治疗靶点。

2.3 CD8+Treg的转化和免疫机制研究CD4+Treg和CD8+Treg是2个主要的Treg类型，与CD4+Treg相比，CD8+Treg研究得较少，它与组织损伤、自身免疫性疾病和肿瘤密切相关[21]，也可通过多种机制在实体器官移植以及移植物抗宿主病中发挥重要作用[22]。Zhang等[23]发现卵巢癌患者中CD8+Treg亚群增加，Treg的标志性分子表达增加，研究将CD8+T细胞与2种卵巢癌细胞以5∶1比例在Transwell小室中共培养5 d，发现CD8+T细胞中Foxp3+、CTLA-4+和CD28+T细胞比例增加。通过对表型和细胞因子分泌的分析显示，与卵巢癌细胞共培养后，外周血CD8+T细胞诱导CD8+Treg的产生并抑制初始CD4+T细胞的增殖，对CD4+T细胞的抑制可能部分通过TGF-β1和IFN-γ介导。将CD8+T细胞与肿瘤细胞共培养阐明了特殊类型CD8+T细胞与肿瘤细胞的相互作用及其可能机制，也为研究免疫微环境中复杂的免疫机制提供了帮助。

2.4 CTL过继免疫疗法的应用CTL过继免疫疗法通过分离特异性CTL，体外扩增并输注至患者体内以杀伤肿瘤细胞，是主要的过继免疫疗法之一。IL-18是一种多效性细胞因子，参与调节固有和适应性免疫应答，也可调节CTL和中性粒细胞活性，在其他细胞因子存在的条件下还能诱导NK细胞等的功能[24]。Kohyama等[25]使用肿瘤患者来源的CD8+CTL与多形性胶质母细胞瘤细胞TKB9、胃腺癌患者腹水来源的GT3TKB和肾癌细胞TUHR13TKB以10∶1比例共培养24 h，研究发现IL-18在体外直接激活CD8+CTL并增强其对体内肿瘤的细胞毒活性，未加入IL-18的CD8+CTL无明显的细胞毒活性，但与IL-18孵育7 d后也显示出细胞毒活性，证明IL-18为CTL过继免疫疗法的优化提供了新方案。将患者来源的CTL与多种肿瘤细胞共培养，为胶质母细胞瘤、胃腺癌、肾癌等提供了过继免疫治疗的可能，细胞因子的加入为优化过继免疫治疗提供了有效支持。

3 各种T细胞与肿瘤细胞共培养方法

T细胞作为肿瘤微环境中主要的免疫细胞，分类方式多样，下表主要列举了与肿瘤细胞共培养的PBMC、CD3+、CD4+和CD8+T细胞以及永生化的Jurkat T细胞，将几种类型T细胞与肿瘤细胞的共培养方法作一简单总结，希望为免疫治疗和免疫机制的研究提供参考(表1)。

表1 T细胞与肿瘤细胞共培养方法概述

4 结语

近年来，肿瘤免疫治疗表现出巨大的潜力，免疫检查点和过继免疫治疗等通过改变T细胞的活性有效发挥抗肿瘤作用，T细胞在肿瘤微环境中的作用越来越不可忽视。文章将T细胞与肿瘤细胞共培养的具体方法作一总结，发现现有的有关T细胞和肿瘤细胞共培养的文献主要涉及在肿瘤微环境中，模拟肿瘤细胞、T细胞、其他免疫细胞、趋化因子和细胞因子等的相互作用，主要应用于T细胞与肿瘤细胞间的相互作用，部分应用于免疫检查点和过继免疫治疗，还有一小部分应用于靶点治疗和新型疗法，探讨了T细胞对肿瘤细胞或肿瘤细胞对T细胞，以及其他免疫相关因素等对T细胞和肿瘤细胞的影响及机制。这仍是研究难点，例如T细胞与肿瘤细胞的体外培养是否需要DC等APC的参与；免疫检查点在体外的研究怎样更好地模拟体内微环境；抗PD-1和CTLA-4抗体在部分患者中应答率不高，是否可以与其他共抑制受体，例如TIM-3和LAG3等联合优化免疫治疗效果，仍需进一步的实验支持。文章综述了各种T细胞与肿瘤细胞的培养方法和应用，期望对T细胞与肿瘤细胞以及T细胞、其他免疫细胞和肿瘤细胞的研究提供参考，也为肿瘤的免疫机制和免疫治疗探索提供帮助。