不同产地黄芪活性成分与硒含量比较分析

靳元元，马生军，徐万里，张 军，耿 阳，吴文平，王雪双

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052； 2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830092；3.特克斯砺剑锋农林科技有限公司 ，新疆特克斯 835500)

0 引 言

【研究意义】黄芪根中含有皂苷、黄酮、多糖和氨基酸等多种活性成分[1]及微量元素硒。黄芪具有保护血管、调节免疫[2]。对不同产地黄芪进行活性成分与硒含量的比较分析，为黄芪资源的开发利用提供理论参考。【前人研究进展】中药黄芪为扶正益气中药[3,4]。我国传统中药富含天然有机硒，研究显示黄芪是硒富集中药中的一种[5]。吴应亮等[6]探究了黄芪、绞股蓝等多种富硒植物，发现黄芪中含有硒皂苷和硒多糖，不同产地黄芪的活性成分含量比较分析已有诸多研究[7-10]，但其与硒含量的相关性尚未报道。富硒黄芪的种植可通过添加适量的外源硒得到高富硒黄芪[11]，或通过活化富硒土壤来提高植物的硒含量[12]。目前治疗疾病的黄芪新剂型，如黄芪口服液、黄芪颗粒、黄芪胶囊等[13]。【本研究切入点】黄芪作为药食同源的中药材，可作为药品，也可作食品相关的功能产品[14]。市场上的黄芪药材产地较广，品质差异较大[15,16]。目前黄芪的研究主要集中在皂苷、黄酮、多糖等成分，而对其硒元素研究较少。不同产地黄芪由于地理环境和土壤条件的不同，其生物学特性和活性成分有一定的差异。【拟解决的关键问题】以22个不同产地黄芪为材料，研究不同产地黄芪活性成分和硒含量的差异，为富硒黄芪资源的开发和综合利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

黄芪药材样品于2018年8月分别采集自新疆、甘肃、山西、内蒙古、宁夏、吉林、陕西等7个省份、22个不同产地，均为2年生人工栽培蒙古黄芪的干燥根，每个采样地点均随机选取15株无明显病害的黄芪植株。表1

表1 不同产地黄芪样品信息

2018年于新疆特克斯县采集5个不同时期的2年生蒙古黄芪和土样。每个时期均随机选取15株无明显病害的黄芪植株，采集土样深度0～40 cm。

黄芪样品50℃烘干，各产地各时期15株黄芪样品全部粉碎后混匀，过60和100目(测硒)筛备用；土样自然晾干，木棍碾碎混匀后过100目筛备用。

1.2 方 法

黄芪中总皂苷、总黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、总多糖及硒含量的测量具体方法如下述，每个指标各样品均设3次重复，建立标准曲线，计算各指标的含量。

1.2.1 总皂苷含量的测定

总皂苷标准品的配制：精准称取黄芪甲苷对照品2.07 mg，置于10 mL容量瓶中，配制成0.207 mg/mL的甲醇溶液。分别精确吸取标准中间液0.02，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL，于具塞玻璃试管中，空气吹干后，加质量分数为5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，于60℃水浴加热20 min，取出后立即冰浴，冷却至室温，再加入冰醋酸5 mL，摇匀；以空白溶剂同法处理作参比，于541 nm波长下测定。

试样的配制：取不同产地粉碎的黄芪样品0.5 g(过60目)，精密称定，加甲醇25 mL，加热回流1 h，过滤，减压回收甲醇(65℃)，残渣用25 mL水饱和正丁醇分3次转移至分液漏斗中，氨试液洗涤3次，每次15 mL，正丁醇层减压回收至干，用甲醇溶解，溶液转移至25 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀。精密吸取0.5 mL溶液至具塞玻璃试管中，空气吹干后，后同标准品，作为供试品溶液。

1.2.2 UV法测定黄芪中总黄酮含量

总黄酮标准品的配制：精准称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品粉末3.20 mg，置于50 mL容量瓶中，配置成0.064 mg/mL的甲醇溶液。分别精确吸取标准中间液1、2、6、8、10 mL置于25 mL容量瓶中甲醇定容至刻度，于260 nm下测定吸光度。

试样的配制：取不同产地粉碎的黄芪样品0.5 g(过60目)，精密称定，量取50 mL甲醇于平底烧瓶中，加热回流1 h，过滤后置于65℃减压回收至干，用色谱甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，摇匀；再移取1.0 mL定溶液至25 mL容量瓶中，用分析甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.3 HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：DIKMA Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(含0.3%磷酸)，梯度洗脱：0～5 min，A为10%～15%；5～15 min，A为15%～23%；15～30 min，A为23%～38%；流速1.0 mL/min；柱温：35℃，进样量10 μL，检测波长：250 nm。该条件下绘出毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品和样品色谱图。图1

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(a)和样品色谱图(b)

1.2.3.2 不同产地黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定

毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品的配制：精准称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品1.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇(色谱纯)溶解并稀释至刻度，配制成0.04 mg/mL的甲醇溶液。分别进样1、3、5、7、10、12 μL，按1.2.3.1项下色谱条件进行测定。

试样的配制：取不同产地粉碎的黄芪样品0.5 g(过60目)，精密称定，量取50 mL甲醇于平底烧瓶中，加热回流1 h，过滤后置于65℃减压回收至干，用色谱甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，摇匀；经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

1.2.4 苯酚—硫酸法测定黄芪中总多糖含量

D(+)-无水葡萄糖标准品的配制：精确称取D(+)-无水葡萄糖50.0 mg，置于100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的D(+)-无水葡萄糖水溶液。分别精确吸取标准中间液1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mL，置于25 mL量瓶中定容，摇匀。精密吸取上述各溶液1 mL，置于10 mL 具塞试管中，加新配置的5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，缓缓加入5 mL浓硫酸，摇匀，90℃水浴加热30 min，冷却至室温。同时做空白试剂，于490 nm下测定吸光度。

试样的配制：取不同产地粉碎的黄芪样品0.5 g(过60目)，精密称定，加入25 mL乙醇溶液浸泡超声提取(功率500/600 W，频率40 kHz，温度80℃)2次，每次20 min，过滤；将滤渣用25 mL蒸馏水在相同条件下提取2次，合并2次滤液，转移至50 mL量瓶中，将残渣用水洗涤2次，洗液并入容量瓶中，定容，摇匀；精密吸取0.2 mL溶液于10 mL具塞试管中，加入蒸馏水1.8 mL，后同标准品，作为供试品溶液。

1.2.5 原子荧光法测定黄芪中硒含量

取不同产地粉碎的黄芪样品0.5 g(过100目)，精密称定，采用氢化物原子荧光光谱法，按 GB5009.93-2010项下“微波消解”处理操作，进行含量测定。

检测与条件：负高压280 V，原子化器高度8 mm，灯电流80 mA，载气和屏蔽气流量分别为400和800 mL/min。

1.3 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Excel 2007进行基础整理分析，采用IBM SPSS Statistics 22统计软件，并对试验数据进行显著分析、相关性分析。

使用 IBM SPSS Statistics 22对不同产地黄芪药材中主要活性成分总皂苷、总黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、总多糖和硒的含量测定结果进行系统聚类，以5种活性成分含量为聚类的变量，选择组间联结作为聚类方法，采用平方Euclidean距离获得聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 线性关系

分别以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、D(+)-无水葡萄糖对照品溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制总皂苷、总黄酮、总多糖标准曲线；以毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准曲线；以硒标准溶液的荧光强度为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制硒的标准曲线。表2

表2 线性关系

2.2 不同产地黄芪活性成分与硒含量比较

研究表明，7个省份不同产地黄芪药材的主要活性成分和硒含量有显著差异(P<0.05)。总皂苷含量最高的是山西省平鲁区为1.557%，最低的是陕西省靖边县为0.630%；总黄酮含量最高的产地是新疆昭苏县为0.472%，最低的是新疆哈密市为0.153%；除新疆图木舒克市、甘肃岷县和内蒙古林东县外，其他19个产地黄芪的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量能达到《中国药典》的要求0.020%；新疆博湖县的总多糖含量和硒含量均是最高，含量分别为27.617%、0.323 mg/kg，总多糖含量最低的是山西浑源县6.283%，硒含量最低的是甘肃省漳县0.112 mg/kg。表3

表3 不同产地黄芪5种成分含量

研究表明，不同省份黄芪药材的活性成分含量有显著差异(P<0.05)，硒含量无显著差异。其中新疆产地的硒、总皂苷和总多糖含量是最高的，分别是0.184 5 mg/kg、1.233%、18.662%；而黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量最高的为宁夏产地，分别为0.412%、0.091 4%。内蒙古产地黄芪最低，含量为0.131 7 mg/kg；就总皂苷而言，陕西产地最低，含量为0.630%；山西产地黄芪总多糖含量最低为8.205%。表4

表4 不同省黄芪5种成分含量比较

2.3 不同时期黄芪根部与土壤硒含量

研究表明，根部的硒含量呈上升趋势，并在最后生长阶段硒含量达到0.28 mg/kg，土壤硒含量呈下降趋势，二者间可能存在一定的相关性。图2

图2 不同时期黄芪根部与土壤硒的含量

2.4 黄芪中硒与活性成分的相关性

研究表明，微量元素硒的含量与总多糖含量呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.609，与总皂苷含量呈显著相关(P<0.05)，相关系数为0.477，黄芪中硒元素与总多糖和皂苷含量密切相关；总黄酮的含量与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.540。表5

表5 相关性

2.5 含量聚类

使用 IBM SPSS Statistics 22对不同产地黄芪药材中主要活性成分总皂苷、总黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、总多糖和硒的含量测定结果进行系统聚类，以5种活性成分含量为聚类的变量，选择组间联结作为聚类方法，采用平方Euclidean距离获得聚类分析树状图。研究表明，22批黄芪样品在阈值为5时可分为3类，其中H1、4、8、12、14～19、21～22为一类，主要特征是各化学成分含量较平均；H2～3、5～6、13、20被聚为一类，主要特征是毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量较高；H7、9～11为一类，主要特征是总多糖含量较高。图3

图3 不同产地22批黄芪样品聚类

3 讨 论

研究中对22个不同产地黄芪总皂苷、总黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、总多糖与硒元素的含量进行检测，并对7个省份黄芪对比分析，结果显示，22个产地黄芪的总皂苷、总黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、总多糖与硒元素的含量的差异具有统计学意义。其中作为传统地道产区的山西平鲁区总皂苷含量最高为1.557%，最低的是陕西省靖边县为0.630%。总黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量最高的为宁夏产地，分别为0.412%、0.091 4%，与田文仓等[17]研究的育苗移栽蒙古黄芪中宁夏产地总黄酮含量最高一致。新疆产地的总皂苷和多糖含量是最高的，分别是1.233%、18.66%，这可能与新疆地域辽阔，日照时间长、昼夜温差大等条件有关，故采收的黄芪产量高、品质高[18]。

22个不同产地黄芪的硒含量范围在0.111 6～0.329 7 mg/kg，其中新疆博湖县产地的黄芪含硒量最高为 0.329 7 mg/kg，博湖县属于新疆目前发现的富硒土壤地区中的焉耆盆地富硒区，其中黄芪有较高的硒生物积累能力[19]。据研究，植物的含硒量与植物种类和土壤含硒量密切相关[20]，中药材中的硒含量与不同富硒区域土壤硒含量呈正相关[21]，故博湖产地黄芪含硒量高。对于土壤硒含量少的产地，可以通过改良土壤或施加外源硒的方式来增加硒的含量[22,23]。

对同一产地不同时期采收的黄芪硒元素含量测定结果表明，采收时期对黄芪硒含量是有一定的影响，但黄芪中活性成分含量和硒含量受土壤及环境因素的影响，对于其他产地的黄芪采收时期还有待进一步的实验验证。

硒是动植物必须的一种微量元素，植物体在吸收硒后可以与多糖结合，以硒多糖的有机硒形式存在植物体中[24,25]。研究表明，黄芪中硒含量与总多糖含量呈极显著(P<0.01)正相关，与总皂苷的含量也呈现显著(P<0.05)相关性，可能是黄芪中硒与总多糖及皂苷结合形成硒多糖和硒皂苷。有研究显示，随着硒含量的升高，植物体多糖、皂苷、黄酮的含量也会随着上升[26,27]，可以推测出植物在生长发育过程中的某个阶段，化学成分之间可能出现物质积累的相似趋势，但具体原因还需要进一步实验验证。

聚类分析根据不同阈值可把22批黄芪分为3大类或5小类，黄芪药材以总皂苷等5种化学成分为指标在地理环境等方面的差异是存在的。在阈值为5时可将新疆博湖县、乌鲁木齐市达板城区、图木舒克市、甘肃渭源县产地黄芪分为一类，其特征是总多糖含量高，且硒含量也均在广西地方标准《富硒农产品硒含量分类要求》的0.15～2.0 mg/kg标准之内，除甘肃渭源县产地外，新疆博湖县、乌鲁木齐市达板城区、图木舒克市产地黄芪的皂苷含量均较高，正好对应相关性分析中，黄芪硒含量与总多糖含量呈极显著相关、与皂苷含量呈显著相关的结果。

4 结 论

不同产地黄芪药材具有一定的差异性，总皂苷含量在0.630%～1.444%，山西省平鲁区居高；总黄酮含量在0.153%～0.472%，新疆昭苏县居高；毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量除新疆图木舒克市、甘肃岷县和内蒙古林东县外，其他19份黄芪药材均达到药典0.020%的要求；新疆产地的黄芪总皂苷和总多糖含量最高，分别是1.233%、18.662%。不同产地土壤条件下黄芪中硒的含量具有差异，同一产地土壤条件下黄芪中硒的含量也具有差异，为富硒黄芪的种植提供了参考。此外，硒含量与总多糖含量呈极显著正相关，新疆博湖县、乌鲁木齐市达板城区、图木舒克市、甘肃渭源县产地黄芪特征是总多糖含量高，且硒含量也均在富硒标准0.15～2.0 mg/kg。