耐辐射丝状真菌F161的分离鉴定及其对锶的吸附特性

张丽娟，唐琦勇，谢玉清，顾美英，王 博，朱 静，宋素琴，黄 伟，张志东，王 玮

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】放射性污染是一类特殊污染[1]。90Sr是锶元素一种具放射性的同位素，是铀的裂变产物之一，可做β射线的放射源，半衰期为28.8年[2]。利用特殊的生物富集和固定放射性污染物的生物修复法具有优势，特别是微生物修复，其成本低且适于大面积修复[3]。为适应生存环境进化出特殊的性质，污染环境和极端环境中存在的微生物，对污染环境具有一定修复能力，尤其是在辐射污染区这一特殊污染环境的微生物，这为利用微生物修复放射性污染奠定了基础。【前人研究进展】细菌、酵母菌、真菌及藻类对金属离子尤其是重金属离子具有良好的吸附效果[4-11]，工业酵母菌开展吸附特征的研究发现，菌体吸附液相中90%以上的Sr2+[12]。赵玉连等[13]研究40株土壤常驻细菌，发现近1/4菌株对Sr2+去除效率在70%～100%。廖上强等[14]研究了1株伯克霍尔德菌对放射性铯的耐受和吸附，液体培养基中的铯去除率达到58.77%。【本研究切入点】目前，国内外开展真菌对核素尤其是放射性核素吸附试验的研究报道相对较少。镰刀真菌F54对放射性铯137Cs的吸附率达到62%。研究耐辐射丝状真菌F161的分离鉴定及其对锶的吸附特性。【拟解决的关键问题】研究1株来自于放射性污染区的土著真菌对Sr2+的吸附作用，为放射性污染的治理提供一些新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200.0 g切成小块，葡萄糖20.0 g，去离子水1 000 mL，115℃灭菌30 min。

分析纯SrCl2配制成Sr2+浓度为2 000 mg/L的储备液，置于100 mL试剂瓶中备用。其余试剂皆为市售分析纯。分析用水为超纯水。

Xseries Ⅱ型电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)，美国Thermo公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株F161的分离、纯化

于新疆某放射性污染地区采集土样。以不同的培养温度、pH、培养基为富集条件，采用平板培养法筛选出一批生长良好的微生物菌株，平板划线法纯化菌株。优选出1株编号为F161的菌株。通过水压片和插片法显微镜下观察其菌丝和产孢形态。参照《真菌鉴定手册》对菌株进行形态学鉴定。纯化后的菌株用PDA固体培养基斜面4℃保存。

1.2.2 菌株F161的分子鉴定

用试剂盒Genview®GV-Filamentous Fungi Genomic DNA Extraction Kit提取菌株基因组DNA。用通用引物ITS1、ITS4扩增ITS序列，用NSI、fung引物扩增18S序列，用PenF1、AspR1引物扩增细胞色素氧化酶I亚基基因cox1序列，用AD3和Q1引物扩增钙调蛋白基因序列，用IN2和Bt2引物扩增β-微管蛋白基因序列，PCR 扩增反应体系为50 μL。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序，序列提交GenBank。

测序结果用Blast搜索软件在GenBank、EMBL等数据库中进行同源比较，选取相似性较高的标准菌株的基因序列，用ClustalX 2.0进行多序列比对，用MEGA 5.0软件采用Saitou和Nei的邻接法(Neighbor Joining)构建系统进化树，bootstrap值1 000。表1

表1 PCR扩增引物序列

1.2.3 菌株F161 生理生化及BIOLOG碳源利用

温度、pH等不同条件对菌株F161生长的影响实验，在PDA琼脂固体培养基上进行。

菌株F161 BIOLOG碳源利用实验，参照姚粟等[18]方法，采用75% T/FF-IF的浊度标准液，将菌株纯培养物制成菌悬液，倒入加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于Biolog FF鉴定微平板的96孔中，接种量为每孔100 μL。接种后的FF鉴定微平板在30℃培养箱静置培养，分别于培养后24、48、76和96 h，读取微平板。

1.2.4 菌株F161生长过程中对Sr2+的吸附特性

取20 mL无菌水与新鲜的F161 PDA斜面均匀混合为菌种悬浊液。配制PDA培养基100 mL(含有SrCl2，终浓度为20 mg/L)于500 mL锥形瓶中。接种0.3 mL 菌悬液，180 r/min，28℃振荡培养，每隔12 h取样1 mL。样品经10 000×g离心5 min，上清液用ICP-MS测定Sr2+浓度。取样后剩余的培养物经真空抽滤至无液体，所得菌体用于计算生物量。设置3个重复，以不接菌的PDA液体培养基作为对照。

单位吸附量和吸附率的计算：

用单位吸附量(qe)和吸附率(R)表征微生物对Sr2+的吸附情况，计算方法式(1)、(2)中。

(1)

(2)

式中，C0为溶液中Sr2+的初始浓度，mg/L；Ct为吸附t时间后溶液中Sr2+的浓度，mg/L；V为吸附溶液体积，L；m为菌株F161的菌体质量，g。

1.2.5 菌体量、吸附时间对F161菌体直接吸附Sr2+的影响

分别称取不同质量的新鲜F161菌体(0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2和1.5 g)置于15 mL Sr2+浓度为20 mg/L的溶液体系内，28℃吸附过夜，取菌悬液离心，经ICP-MS测定上清液的Sr2+浓度。

称取0.5 g菌体，分别震荡悬浮于Sr2+浓度为20 mg/L的10 mL溶液体系内，28℃每间隔1 h取样。样品经ICP-MS测定上清液最终Sr2+浓度。

所有试验均设置3个重复。

1.2.6 菌株F161耐受辐射、重金属能力及吸附放射性90Sr的能力测定

菌株F161培养物γ辐射耐受特性以Ferreira等已建立的方法做验证[19]。菌株F161接种于液体PDA培养基内，180 r/min，28℃摇床培养至稳定期，4℃离心收集菌体，以生理盐水洗涤并重新悬浮。放射源60Co以0.167 kGy/min的剂量率在室温下进行照射。照射剂量以2.0 kGy的幅度从0 kGy升到16.0 kGy。照射后的样品稀释涂布至PDA平板上，28℃静置培养3～5 d后观察是否生长，以检测F161对于γ辐射的耐受特性。每个辐照剂量设置3个重复。

将F161菌种接种含重金属离子的PDA固体培养基，28℃静置培养72 h，观察菌落的生长情况。实验用重金属离子为Cr2+、Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+，PDA培养基中的最终浓度梯度设置为50、100、200和500 mg/L。同时按2%接种量分别接种对应浓度重金属离子的PDA液体培养基，28℃，180 r/min振荡培养72 h，观察液体中菌丝球的生长情况。

在PDA液体培养基中加入1 mL(1 805.5 bq)放射性90Sr母液，按2%接种量接种真菌F161，28℃、180 r/min震荡培养72 h，收集样品，离心去除菌体，收集上清。采用液闪检测仪测定上清液中放射性90Sr的放射活度。设置3个重复。

放射性锶的吸附率的计算方法：

(3)

式中，℃为溶液中放射性Sr的初始放射性活度，bq；Ct为吸附t时间后溶液中放射性Sr的放射性活度，bq。

2 结果与分析

2.1 菌株 F161的分离纯化及鉴定

研究表明，在PDA琼脂平板上初生菌落白色，绒毛状，向外扩展快，随着培养时间菌落先呈现淡粉紫色后期由边缘开始逐渐变青色，最终菌落呈青色，质地绒粉状，有同心圆环。分生孢子梗从气丝垂直生出，无厚壁足细胞。分生孢子梗有隔不分枝，光滑，在略膨大的顶端对称排列着单居瓶状小梗，小梗上着生链状分生孢子，孢子椭圆形，表面光滑带有土黄的杂绿色。根据以上形态特征，鉴定该菌株为属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属的1个种，属于青霉属(Penicilliumsp.)。图1

图1 F161的菌落形态(a)(b)和显微镜下形态(c)(d)(10×20倍)

菌株F161的最适宜培养温度是28～30℃，最适pH 7.0，最适培养基PDA培养基，最适宜NaCl浓度为2%～4%，最适宜KCl浓度为2%～4%，最适宜MgCl2浓度为1%～2%。F161可利用以下26种碳源：熊果苷、糊精、赤藻糖醇、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐、丙三醇、D-核糖、水杨苷、D-木糖、γ-氨基丁酸、 ß-羟基丁酸、奎尼酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-苏胺酸、2-氨基乙醇、腺苷-5’-磷酸盐。Biolog FF鉴定板的数据经系统判读比对，菌F161的碳源代谢特征与草酸青霉PenicilliumoxalicmCurrie&Thom同源性最高，SIM值为0.432。 表2

表2 不同条件下菌株F161的生长

将菌株的ITS、18S、cytochrome c oxidase subunit 1、Calmodulin、β-tublin基因序列上传Genbank。通过序列比对， ITS 基因序列(Genbank No. MN818666)比对后与P.oxalicumsstrain WZ-119多株菌同源性达100%。18S基因序列(Genebank No. MT233418)通过比对，与P.oxalicumstrainTGQM01等多株P.oxalicum菌同源性为100%。Calmodulin基因序列比对后菌株与PenicilliumoxalicumstrainITEM7573同源性最高(99.80%)。cox1基因序列比对后与P.oxalicumvoucher226606同源性100%同源性100%。β-tublin序列经数据库比对后，与P.oxalicumstrainCGMCC 3.18171同源性100%。菌株F161为青霉属草酸青霉种P.oxalicum。图2～4

图2 基于cox1基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系统发育树状图

图3 基于钙调蛋白基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系统发育树状图

图4 基于β微管蛋白基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系统发育树状图

2.2 菌株F161生长过程中对Sr2+的吸附以及pH对菌株F161吸附Sr2+的影响

研究表明，28℃、pH 7.0 的生长条件下，培养基中Sr2+的初始浓度为20 mg/L，F161菌对Sr2+的吸附率随着时间而急速增长，在48 h左右达到最高值，吸附率在36.67%左右，继续培养至96 h吸附率随时间变化不大，96 h后湿菌重量和吸附率开始有回升的趋势。图5

图5 青霉(Penicillium sp.) F161在20 mg/L Sr2+压力下生长曲线及吸附特性

选择pH 4.0～9.0作为初始的pH，180 r/min，28℃摇床培养,测定F161菌对Sr2+的吸附率。取样经ICP-MS检测发现培养基的初始pH对生长吸附的影响较大，pH 4～6时，随着pH的增加，吸附率明显上升，在pH 6.0时，吸附率最高89.42%，pH 6～8时，吸附率随着pH升高而缓慢下降。图6

图6 不同pH下青霉(Penicillium sp.)F161生长吸附Sr2+变化

2.3 菌体量、吸附时间对F161菌体直接吸附Sr2+的影响

研究表明，在以新鲜菌体为材料进行吸附时，在15 mL Sr2+浓度为20 mg/L的溶液体系内，随着菌体量的增加，吸附率逐渐上升至峰值17.31%后基本稳定，不再随菌体量的增加而增加。单位菌体吸附量在最初达到最高0.23 mg/g后，随菌体量的增加逐渐降低。

吸附时间对于菌体吸附的影响：称取0.5 g菌体，均匀悬浮于Sr2+浓度为20 mg/L的10 mL溶液体系内，间隔1 h取样。样品经ICP-MS测定，菌体吸附率远远低于生长吸附，随着时间的增加吸附率并没有显著增加，只是在一定的值范围上下波动。图7

图7 不同菌体添加量(a)、吸附时间(b)下青霉(Penicillium sp .)F161菌体吸附Sr2+变化

2.4 菌株F161的耐受辐射、耐受重金属的能力及其对放射性90Sr的吸附

研究表明，菌株F161菌体经放射源60Co以0.167 kGy/ min的剂量率在室温下进行照射，照射剂量达到16.0 kGy时，照射后的菌体仍能在PDA平板上生长，F161能够耐受高达16Gry的γ辐射。

耐辐射青霉(Penicilliumsp .)F161对Pb2+、Zn2+、Ni+、Co2+、Cr2+、Hg2+等6种重金属均具有很高的耐受性，其中对Pb2+、Cr2+的耐受浓度最大，均可达500 mg/L；对Co2+、Hg2+、Zn2+的耐受性次之，均可达100 mg/L。

F161对放射性90Sr吸附率达到49.45%。图8

图8 F161对不同金属离子的耐受

3 讨 论

微生物是地球上分布最广的生物，体积小，表面积大，繁殖快，适应能力强，可用于各类污染环境的治理和修复[20-22]。研究筛选获得的丝状真菌F161，产生青霉属典型的帚状的分生孢子，通过多个保守基因的序列比对分析，均与草酸青霉种同源性最高。通过传统的形态学观察结合分子生物学鉴定，菌株F161为1株草酸青霉，最适宜培养温度是28～30℃，最适pH 7.0。Biolog试验表明，菌株F161可以利用26种碳源。根据前人报道，草酸青霉具有多种生物活性，能够产生有机酸活化土壤磷[23]，强化土壤有机质分解[24]，改良土壤提高肥力。在污染治理方面，用草酸青霉处理高盐Cr(VI)废水和吸附重金属离子[25,26]，然而其对于放射性核素方面的研究相对较少。

利用微生物修复放射性污染，所选择的微生物必须有一定辐射耐受性；不能产生2次污染[27,28]。目前，已经有利用耐辐射异球菌Deinococcusradiodurans生物膜的新型铀生物修复方法的报道[29]，前期研究也发现了一些既有辐射抗性，又对放射性核素具有吸附特性的微生物，如曲霉F77、链孢霉F54[30-31]。研究中菌株F161能够耐受10 Gry的辐射剂量，对放射性90Sr具有较好的吸附作用，吸附率49.45%，同时对多种重金属离子(Cr2+，Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+)具有很好的耐受性。

微生物通过吸附、富集、转化、降解等作用转化或去除环境中的重金属和放射性核素污染物[32-33]。对辐射污染的治理基本都是利用微生物富集吸附核素的特性，如Myxococcusxanthus和Aspergillusfumigatus都能吸附核素铀[34]，酿酒酵母能吸附核素铀、锶和铯[35]。在吸附温度28℃、初始pH 7.0、Sr2+的初始浓度为20 mg/L条件下，F161生长曲线与吸附曲线基本吻合，二者在48 h达到峰值36.37%，此后随着菌体的老化、自溶，吸附率略有下降。这主要是由于随着菌丝体生长进入稳定期，细胞对Sr2+的吸附逐渐达到饱和。随着培养时间的延长，微生物对Sr2+的吸附率略有降低，表明随着营养物质消耗殆尽，菌体开始死亡，甚至出现自溶现象，打破固液吸附平衡，造成菌体吸附率下降。研究发现，培养液初始pH对菌的吸附效果产生明显的影响，发现pH 6.0是F161生长吸附的最佳初始pH，微酸性环境有利于Sr2+的吸附，得到F161对Sr2+的最高吸附率89.42%。

在对粘球菌、曲霉、酵母的放射性核素吸附研究中，多是以菌体作为材料来做研究的[34,35]。研究尝试建立以F161新鲜菌体为材料的吸附体系，发现菌体的吸附率远低于生长吸附。随着菌体添加量的增加，吸附率逐渐上升至峰值17.31%后基本稳定，不再随菌体量的增加而增加。单位菌体吸附量在最初达到最高0.23 mg/g后，随菌体量的增加逐渐降低。随着取样时间的延伸，菌体吸附率只是在一定的值范围上下波动，吸附可能在菌体添加的最初短时间内完成的。

4 结 论

4.1 土著真菌F161经鉴定为草酸青霉。该菌最适宜培养基为PDA培养基，最适宜生长温度28～30℃，最适宜pH 7.0。F161能耐受 10 Gry辐射剂量，对重金属离子Cr2+、Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+具有很好的耐受性，可一边生长一边吸附积累90Sr。

4.2 在吸附温度28℃、初始pH 7.0、Sr2+的初始浓度为20 mg/L震荡培养条件下，F161生长过程中，随着菌体量的增加，吸附率也在增加，二者曲线基本温和，48 h达到峰值36.67%，培养基的初始pH对生长吸附的影响较大，pH 6.0时获得该菌对Sr2+的最高吸附率89.42%。

4.3 直接利用新鲜菌体材料吸附溶液中的Sr2+效果远差于伴随成长过程的吸附，F161新鲜菌体对Sr2+的吸附率并不随着吸附时间的延长而增加。

4.4 F161是1株对放射性核素污染具有修复能力的土著丝状真菌，在有较高的重金属离子混合污染的放射性环境中具有一定的修复应用潜力。