哈萨克母羊分娩前与胎儿组织器官细菌的多样性

李晓斌，马 晨，李凤鸣，黄新新，米热古丽·伊马木，臧长江，李佳豪，李 超，马利鑫，曹 蕊

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】微生物代谢在妊娠期扮演者重要角色，是确保母体和胎儿健康的关键[1]。妊娠期母体与胎儿之间微生物传播研究开始增多[2-4]。研究母体与胎儿之间存在微生物传播的可能，对深入了解这类细菌进入羊水后对胎儿胃肠道菌群多样性的影响具有重要的意义。【前人研究进展】早期研究，新生动物肠道获取的第一批微生物来自分娩过程母体的产道，通过第1次哺乳后不断增加并丰富。近期，更多的研究发现，新生动物在胎儿期就已经感染一定量的微生物[5]，母体羊水并非无菌，母体与胎儿之间存在微生物传播的可能机制[6-7]。而这种可能在妊娠小鼠及孕妇中得到了证实。Walker等[8]给怀孕的小鼠口服荧光标记粪肠球菌试验结果显示，其子代小鼠胎便中分离出带标记的粪肠球菌，而对照组(未口服荧光标记粪肠球菌)小鼠子代则未检测出荧光标记的粪肠球菌。张烨等[9]研究给孕妇服用益生菌，在子代的胎便中也可以检测到母体服用的益生菌。【本研究切入点】当前，关于哈萨克羊母羊分娩前及胎儿相关部位细菌多样性的研究鲜见。研究分娩前哈萨克母羊和胎儿组织、肠道内容物及相关器官菌群的多样性。【拟解决的关键问题】以分娩前哈萨克妊娠母羊为研究对象，采用屠宰试验，研究母、胎相关组织、器官菌群结构和多样性，为进一步揭示母胎间微生物传播的可能及调控新生羔羊肠道菌群定殖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

选择5只4岁、平均体重(55.64±4.37) kg的健康妊娠后期的哈萨克母羊，所有试验动物在同一饲养环境下舍饲饲养。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将5只妊娠后期哈萨克母羊安乐死，颈部放血，在屠宰前用无菌脱脂棉，采集母羊唾液后。根据解剖生理学，将母羊解剖，并获取相关组织和样品。

1.2.2 样品采集

1.2.2.1 母羊唾液(SA)样品采集

将无菌脱脂棉放入母羊口腔，蘸取母羊唾液后，立即装入10 mL无菌冻存管，液氮冷冻，待测。

1.2.2.2 羊水(AF)样品采集

将母羊解剖后，分离子宫，用50 mL的无菌注射器抽取羊水，立即转入50 mL无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.3 脐带(UC)样品采集

用无菌手术剪刀剪取脐带约10 cm，立即装入50 mL无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.4 母羊瘤胃液(RU)样品采集

将母羊瘤胃打开，将瘤胃内容物倒入灭菌的过滤袋内，收集滤液，混匀后，采集50 mL于无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.5 母羊小肠内容物(SI)样品采集

分离母羊小肠，并收集全部小肠内容物于灭菌烧杯，混合均匀后，采集20 g于无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.6 母羊盲肠内容物(CE)样品采集

分离母羊盲肠，并收集全部盲肠内容物于灭菌烧杯，混合均匀后，采集20 g于无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.7 羔羊瘤胃内容物(RF)样品物采集

将羔羊从胎盘内剥离，解剖分离瘤胃，将全部瘤胃内容物收集于50 mL无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.2.8 羔羊胎粪(ME)样品采集

分离胎儿的结肠和直肠，采集全部内容物于50 mL无菌冻存管内，液氮冷冻，待测。

1.2.3 样品检测

1.2.3.1 样品DNA提取及PCR扩增

取大约0.25 g样品采用十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取样本的基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，稀释至1 ng/μL备用。以稀释后的基因组DNA为模板，使用16S rDNA的V4区特异引物515F和806R进行PCR扩增。

1.2.3.2 PCR产物的混样和纯化

PCR产物用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测。根据PCR产物浓度进行等量混样，混匀后用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目标条带。

1.2.3.3 文库构建与测序

使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒进行文库构建，构建好的文库经检测合格后，使用Hiseq 2500 PE250上机测序。

1.3 数据处理

从下机数据中拆分出样品数据，然后截去Barcode和引物序列用于拼接，得到的拼接序列为原始数据。参照Qiime的质量控制流程，将原始数据进行截取，并过滤掉其中连续高质量碱基长度小于序列长度75%的数据。经过以上处理后得到的序列与数据库进行比对，检测并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

利用Uparse软件得到的有效数据进行聚类，以97%的一致性将序列聚类为OTUs(Operational Taxonomic Units)。采用RDP Classifier方法与GreenGene数据库对OTUs代表序列进行物种注释分析(阈值设定为0.8～1)，分别在门(Phylum)、科(Family)和属(Genus)的分类水平上统计样本的群落组成。

2 结果与分析

2.1 多样性分析

研究表明，在羔羊瘤胃内容物、羔羊胎粪、羊水及母羊唾液发现数量较多的物种。母羊唾液、小肠和盲肠内容物、羊水及羔羊胎粪中有较高的shannon指数，分别为7.22、6.39、6.81、6.50、6.25。chao1和ACE指数在母羊唾液、小肠内容物和羊水中较高，分别为1 042.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17。表1

表1 OTUs数量及α-多样性

2.2 门水平菌群丰度

研究表明，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)在母羊和胎儿各组织器官种内容物中占比最高，细菌数量总和占菌数量的80%以上。羊水中蓝细菌丰度较高为29.44%；在母羊口腔和胎儿瘤胃中变形菌门的丰度分别为41.92%和64.92%，高于母羊和胎儿其他组织器官中细菌的占比；在脐带、羊水、胎儿瘤胃内容物和胎粪中发现了占比较高的放线菌门，分别为10.43%、8.20%、6.61%和3.44%。厚壁菌门和拟杆菌门在母羊瘤胃中分别为30.89%和51.810%，而在胎儿瘤胃中分别为10.37%和10.73%。表2

表2 门水平丰度前10的物种

2.3 科水平菌群丰度

研究表明，鞘酯菌科在胎儿瘤胃、胎粪及脐带中有较高的丰度，分别为55.31%、9.07%和2.19%。在母羊的唾液、脐带和胎粪中检测到丰富的莫拉菌科，分别为25.92%、8.43%和12.01%。在母羊和胎儿所有组织器官中均检测出较为丰富的瘤胃菌科、普雷沃氏菌科和毛螺菌科，其中瘤胃菌科在母羊小肠和盲肠内容物中分别为34.67%和41.14%，普雷沃氏菌科在母羊唾液和瘤胃液中分别为14.40%和25.32%，毛螺菌科在母羊盲肠内容物、脐带及胎粪中分别为13.74%、8.86%和8.08%。此外，在母羊唾液中奈瑟氏菌科丰度为8.87%，母羊瘤胃液中琥珀酸弧菌科和理研菌科丰度分别为12.93%和10.43%，母羊小肠中肠杆菌科丰度为8.92%，母羊盲肠内容物中琥珀酸弧菌科丰度为8.82%。表3

表3 科水平丰度排在前10的物种丰度

2.4 属水平菌群丰度

研究表明，在母羊唾液中检测出丰度较高Moraxella(20.37%)、丝状小链菌(5.44%)、不动细菌属(4.28%)、单胞菌(4.29%)、链球菌属(4.15%)和梭杆菌属(3.18%)。母羊瘤胃液中检测出丰度较高的Succinivibrio(10.04%)和unidentified_Bacteroidales(4.83%)。在母羊小肠内容物中检测到丰度较高unidentified_Ruminococcaceae(16.50%)、Romboutsia(6.00%)和Candidatus_Saccharimonas(3.23%)。在母羊盲肠内容物中检测到丰度较高的Succinivibrio(8.79%)、Faecalibacterium(12.45%)、拟杆菌属(5.74%)、罗斯氏菌属(3.84%)及Erysipelatoclostridium(2.42%)。在羔羊瘤胃液中检测到占比55.17%Sphingomonas。在羔羊胎粪中分别检测到丰度较高的Moraxella(5.37%)、Faecalibacterium(3.88%)、巨单胞菌属(4.56%)、慢生根瘤菌属(3.05%)及罗斯氏菌属(3.32%)。在脐带中检测出丰度较高的嗜冷杆菌(10.11%)、Faecalibacterium(4.03%)、双歧杆菌属(3.75%)、肉杆菌属(3.62%)、Jeotgalicoccus(3.65%)、拟杆菌属(2.48%)及链球菌属(4.27%)。在羊水中检测到丰度较高的unidentified_Cyanobacteria(29.44%)、海杆菌属(5.37%)及Ignatzschineria(3.50%)。图1

注：嗜冷杆菌(Psychrobacter)、丝状小链菌(Alysiella)、巨单胞菌属(Megamonas)、不动细菌属(Acinetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肉杆菌属(Atopostipes)、单胞菌(Porphyromonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、放线杆菌属 (Actinobacillus)、海杆菌属(Marinobacter)、罗斯氏菌属(Roseburia)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、链球菌属(Streptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)

2.5 类聚图

研究表明，羔羊瘤胃液、胎粪及脐带中物种相似性较高，母羊唾液和瘤胃液中物种相似性较高，母羊小肠内容物和母羊盲肠内容物中物种相似性较高，而羊水中物种的与其他组织相似性较低。图2

注：分别是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、软壁菌门(Tenericutes)、迷踪菌门(Elusimicrobia)及螺旋体门(Spirochaetes)

3 讨 论

母体微生物在一定程度上影响胎儿的发育及健康[10]，这种影响在早期的研究中认为是通过微生物代谢产生各类营养物质影响胎儿健康的[11-12]。起初研究中，认为动物胎盘、羊水是无菌的，胎盘中细菌可能是生殖道感染引起的[13-44]。Kovalovszki等[15]的研究结果首次证明母体胎盘中存在一定量的需氧细菌，并发现无任何感染的胎盘绒毛膜中仍然存在一定的细菌，胎盘及羊水中的细菌与产道是否炎症无关。Walker等[8]及张烨等[9]研究证实母体与胎儿之间存在微生物传播的可能。胎儿在孕期已经具备从母体获得微生物的可能。

结果显示，胎儿瘤胃内容物、胎粪及羊水、脐带中均存在细菌多样性，shannon、Simpson、chao1、ACE指数与母羊唾液、瘤胃液、小肠和盲肠内容物相似。姚雪等[16]报道，孕妇在妊娠期肠道中α-菌群多样性降低，β-菌群多样性升高；在阴道中α-、β-菌群多样性均降低。试验在母羊唾液、小肠内容物和羊水中chao1、ACE指数均在1 000以上，孕期母羊唾液、小肠内容物和羊水中菌群多样性较高。临产前的羔羊在母体胎盘中已经感染了一定量的微生物，母体与胎儿之间具备微生物传播的机制，这与姚雪等[16]报道一致，妊娠期人的胎盘并非无菌，而是存在一定的耗氧菌和厌氧菌，且羊水中存在细菌已被逐渐证明。

在门水平胎儿各组织器官分别检测到丰度较高的厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、软壁菌门(Tenericutes)、迷踪菌门(Elusimicrobia)及螺旋体门(Spirochaetes)。在母羊的小肠、盲肠内容物和脐带中检测到丰度较高的厚壁菌门(分别为79.08%、65.95%及49.66%)；拟杆菌门在母羊瘤胃内容物中最高为51.80%。Koren等[17]为了研究妊娠早期和后期肠道菌群丰度差异，将这2个阶段肠道菌接种到无菌小鼠的肠道内，结果发现，妊娠早期肠道菌群以厚壁菌门菌(Firmicutes)和拟杆菌门菌(Bacteroidetes)为主，变形菌门比例非常少；而妊娠后期变形菌门菌丰度较高，厚壁菌门菌和拟杆菌门菌的丰度占比明显减少。试验中妊娠母羊唾液和胎儿瘤胃中变形菌门的丰度分别为41.92%和64.92%，相应厚壁菌门和拟杆菌门丰度降低，这一结果与Koren等研究结果不同，可能与研究对象、日粮结构类型等有关。Kovalovszki等[15]通过培养的方法，首次在胎盘样本中发现需氧细菌，并发现即使在没有任何绒毛膜羊膜炎组织学证据的胎盘中，细菌仍然是存在的，且胎盘微生物主要是变形菌门。胎盘微生物组成与口腔微生物最为相似，都有较高含量的普氏杆菌和奈瑟氏菌[18]。试验结果中母羊唾液中门水平菌群丰度比例与脐带和胎粪的相似度较高。有研究表明，革兰阴性的口腔厌氧菌具核梭杆菌存在黏附素FadA ，它能够与血管内皮的钙黏蛋白结合，改变血管内皮的渗透压，从而使得其他微生物种群，如大肠埃希菌等更轻易地穿过血管内皮屏障[19]。可以解释口腔菌群与胎盘菌群相似性高的原因。

早期研究认为胎粪是无菌的，但最近的研究显示，胎粪中检测到一定量的肠球菌、肠杆菌、明串珠菌属、乳球菌属和链球菌等[20]。与成年粪便样品菌群相比较，胎粪微生物多样性较低，个体间的差异更高，拟杆菌门整体减少，但变形杆菌富集增加，这与试验在胎粪中检测到丰度较高变形菌门结果相一致。

4 结 论

母羊妊娠后期唾液、小肠内容物及羊水中有较高的chao1和ACE指数分别是104.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17；母羊唾液中变形菌门和莫拉菌科丰度最高，分别为41.92%和25.92%；瘤胃液中拟杆菌门和普雷沃氏菌科分别为51.80%和25.32%；母羊小肠和盲肠内容物中厚壁菌门和瘤胃菌科分别为79.08%、65.95%和34.67%、41.14%；羔羊瘤胃液中变形菌门和鞘酯菌科分别为64.92%和55.31%；羔羊胎粪和脐带中厚壁菌门分别为35.69%和49.66%。厚壁菌门、变形菌门及拟杆菌门是此阶段母羊和胎儿各组织器官主要的物种。