外周血单个核细胞miR-150表达对STEMI患者PCI术后发生左心室重构的预测价值

高红霞，杨彩霞，任刚

(铁岭市中心医院 心内科，辽宁 铁岭 112000)

尽管经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)可迅速恢复心肌灌注，但仍有部分患者会出现左室功能障碍，从而导致不利的心肌重塑[1]。左心室重构(left ventricular remodeling，LVR)过程大大增加了严重心血管不良事件包括死亡的风险[2]。因此对LVR进行早期危险分层有助于对高危患者进行密切观察和更积极的治疗。微小RNA(miRNAs)的发现为识别生物标志物和开发新的治疗工具提供了新的机会。最近有学者发现miR-150对于大鼠成纤维细胞增殖活性具有负性调节作用[3]，其在心肌梗死边缘区表达下降，且可通过靶基因c-Myb改善心肌纤维化[4]；此外罗穆玲等[5]也证实老年慢性心衰患者血清miR-150表达与心室重构有关。在本研究中，我们旨在探讨ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者PCI术后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR-150表达与LVR发生的潜在关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2018年3月至2019年1月在我院接受急诊PCI术的165例STEMI患者完成本队列研究，患者以典型急性胸痛和持续性ST段抬高为特征[≥30 min，以V2～V3导联ST段抬高(在J点处)≥0.2 mV(男性)或ST段抬高≥0.15 mV(女性)为基础表现，完成心梗4项检查]，发病24 h内行急诊PCI术。如果PCI术失败(病变部位残留狭窄>30%)、预计生存时间<12个月、合并肝硬化或其他严重心脏病变(心瓣膜病、心肌病或心包膜疾病)、有肾脏病史、已知的恶性肿瘤、炎症或严重感染性疾病者，则被排除在本研究之外。在1年的随访期间，所有患者服用阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1，并在1年后进行超声心动图评估。本研究方案得到了我院伦理委员会的批准，所有患者都签署了书面的知情同意书。

1.2 超声心动图检查

所有患者PCI术后7 d和随访1年后接受经胸超声心动图检查(飞利浦iE33型超声心动图仪)。静脉注射0.5 ml造影剂SonoVue，保存心尖部四腔心切面和心尖部二腔心切面的视图，通过双平面法测量左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)和左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。术后1年复查超声心动图时，若LVEDV比出院时增加≥20%则定义为LVR[6]。超声心动图的检查由2位经验丰富的技师完成，并对获得的数据进行离线处理。根据复查时是否发生LVR，将患者分为LVR组和非LVR组。

1.3 实时荧光定量PCR法检测PBMCs中miR-150表达

所有患者PCI术后7 d采集外周血样本，储存在经EDTA-2K处理过的试管里。采血时间点与第1次超声心动图检查时间一致。然后，采用试剂盒(美国cedarlane公司)用淋巴溶解液分离PBMCs。在提取RNA之前，PBMCs在无菌PBS中洗涤2次。用Trizol从PBMCs样本中提取总RNA。用NanoDrop 2000分光光度计检测光密度(optical density，OD)260/OD280和OD260/OD230，测定RNA的浓度和质量。应用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR检测试剂盒(美国Gene Copoeia公司)对总miRNAs进行逆转录，转化为cDNA。将cDNA样本保存在-20 ℃冰箱中。采用SYBR Green miRNA分析试剂盒(AceQTMqPCR Kit，中国Vazyme Biotech公司)配制20 μl PCR反应体系，包含1.0 μl cDNA模板和各0.5 μl上下游引物。miR-150引物：正向5′-CTGTGTCCTGCCAGTGGTTTT-3′，反向5′-CGGTATCCTGTCCGTGGTTCT-3′；内源性对照小分子U6 mRNA引物：正向5′-CGCGTTCGGCCACATAC-3′，反向5′-CAGGCCATGCTCTAATCTT-3′。PCR参数：95 ℃单循环5 min，95 ℃ 10 s和65 ℃ 40 s循环40次。PCR在ABI ViiA7实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)上完成。用2-ΔΔCt法测定miR-150表达量，并以小分子U6 mRNA作为内控。

1.4 其他实验室指标检测

PCI术后7 d检测各项实验室指标，取血样置于真空管中，立即转移到中心实验室，分别检测血浆N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB type，CK-MB)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)。用电化学发光免疫分析法(Roche Elecsys E170电化学发光仪)检测血浆NT-proBNP水平，采用双抗体夹心法(Roche Elecsys 2010 电化学发光免疫分析仪)检测血浆cTnT、CK-MB水平，用胶乳增强免疫透射比浊法(Roche Cobas 8000自动化学分析仪)检测血浆CRP水平。

1.5 双荧光素酶报告基因分析

用含有10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养人HEK293T细胞，用于荧光素酶活性测定。用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)和10 ng报告质粒共转染细胞，报告质粒包含荧光素酶报告基因下游插入CRP的3′非翻译区(3′UTR)和30 nmol·L-1miR-150模拟物或阴性对照作为miR-150 mimics组和miR-NC组。分别与CRP 3′UTR野生型序列或突变型序列转染24 h后用双发光试剂盒(美国Genecopoeia公司)测定荧光素酶活性。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

随访1年，35例患者发生LVR，LVR发生率为21.21%。所有患者PCI术后都达到TIMI3级血流。LVR组和非LVR组STEMI患者的年龄、性别、体重指数、吸烟史、既往疾病史、罪犯血管类型、冠脉病变支数、支架选择及PCI术后用药情况比较，差异均无统计学意义(均P>0.05，表1)。

表1 两组STEMI患者一般资料的比较

2.2 两组术后7 d各项实验室指标的差异

与非LVR组相比，LVR组患者血浆NT-proBNP、cTnI、CK-MB、CRP水平升高，同时PBMCs中miR-150相对表达量降低，差异均有统计学意义(均P<0.05，表2)。

表2 两组STEMI患者PCI术后7 d PBMCs中miR-150表达量及血浆NT-proBNP、cTnT、CK-MB、CRP水平的比较

2.3 影响STEMI患者PCI术后发生LVR的危险因素

经多因素Logistic回归分析，STEMI患者PCI术后7 d时PBMCs中miR-150表达量、血浆CK-MB水平以及LVEF都是STEMI患者PCI术后发生LVR的独立预测因素(P<0.05，表3)。

表3 单因素和多因素Logistic回归分析影响STEMI患者PCI术后发生LVR的临床因素

2.4 PCI术后7 d时PBMCs中miR-150表达量、血浆CK-MB水平以及LVEF对LVR发生的预测价值

ROC曲线分析显示，PCI术后7 d PBMCs中miR-150表达量和联合指标预测LVR的曲线下面积(area under curve，AUC)大于单独使用LVEF的AUC，差异有统计学意义(Z=-3.327、3.458，均P<0.05)(表4)。

表4 ROC曲线分析PCI术后7 d时PBMCs中miR-150表达量、血浆CK-MB水平以及LVEF对LVR的预测价值

2.5 双荧光素酶报告基因分析miR-150和CRP的关系

生物信息学分析显示，miR-150和CRP之间存在互补碱基对。荧光素酶报告基因分析显示，miR-150模拟物抑制了CRP-3′UTR-WT的荧光素酶活性(P<0.05，图1)。

图1 双荧光素酶报告基因法测定CRP mRNA和miR-150的靶向调控关系

3 讨 论

对于STEMI患者PCI术后发生LVR，是导致死亡的重要危险因素之一[7]。因此，在分子水平上寻求对生物学途径的更深入了解，以及寻找可能预测LVR的潜在指标具有重要的临床价值。在本研究中，我们测定了STEMI患者PCI术后7 d时PBMCs中miR-150以及血浆cTnI、CK-MB、NT-proBNP的浓度，并评价LVEF，以确定这些生物标志物是否能在1年内预测LVR的发生。与未发生LVR的患者相比，LVR组患者PCI术后7 d时血浆NT-proBNP、cTnI、CK-MB水平升高，同时PBMCs中miR-150相对表达量降低；此外LVEF降低也是影响LVR发生的独立危险因素之一。虽然既往有报道指出，急性期cTnI和NT-proBNP浓度可以预测LVR，但是STEMI患者PCI术后影响这两项指标的客观因素太多，因此他们对于LVR的预测能力较差。我们发现PCI术后7 d时PBMCs中miR-150表达、血浆CK-MB水平以及LVEF可以预测PCI术后1内发生LVR的风险。

心肌梗死后LVR的机制是多因素的。心肌细胞坏死触发的细胞内信号调节扩张、肥大和胶原瘢痕的形成过程[8]。在心肌梗死早期，心室扩张和室壁变薄主要是由梗死区扩张引起的。随着时间的推移，血管壁张力增加，微循环功能障碍和炎症介质进一步推动肾素-血管紧张素-醛固酮系统和拟交感神经系统，导致心肌细胞肥大和代偿性左心室扩张[9]。以往的研究表明，心肌损伤程度与LVR相关[10]。本研究中我们也发现LVR组和非LVR组患者在PCI术后7 d时血浆NT-proBNP、CK-MB水平差异有统计学意义，而且血浆CK-MB水平和LVEF是1年内发生LVR的独立预测指标。其可能的解释为，在心肌梗死后早期，大面积梗死区扩大后，可能通过非梗死性心肌肥大和球形左室重塑进行更大程度的后期重塑，作为全面心肌功能减退的代偿机制(Frank-Starling效应)[11]。

miRNAs是以细胞和组织特异性方式表达的短寡核苷酸，具有调节基因表达和器官(包括心肌)功能的作用。由于在人类外周血液中发现了它们的存在，并具有稳定性，miRNAs已经显示出作为心血管疾病循环生物标志物的潜力[12]。一些研究已经报道了miRNAs表达失调在心脏衰竭或心肌肥厚中的功能性作用。Ma等[13]报道急性心肌梗死患者入院时血液循环miR-1是6个月内发生心室重塑的独立预测指标，而且与之前的临床测量结果相比显示出更高的预测效能。在本研究中，我们则发现PCI术后7 d PBMCs中miR-150表达水平降低可以预测STEMI患者PCI术后1年内LVR的发生风险。虽然miR-150的预后价值已经在脓毒症[14]、急性白血病[15]患者中被报道过，但是与心肌梗死后LVR的关系尚未见明确的临床报道。在一些基础研究和其他疾病研究中，miR-150被证实是与炎症有关的调节基因，而且主要表达于单个核细胞中。由于炎症是心肌梗死后LVR发展的关键机制，未来的研究需要确定 miR-150在这种重塑中的作用。Luo等[16]通过对ApoE-/-小鼠模型注射miR-150 mimics，发现可以通过干扰PTX3、NF-κB1和RELA表达促进内皮细胞增殖、迁移，抑制血管重构。Devaux等[3]通过冠状动脉结扎构建心肌梗死小鼠模型，诱导心肌梗死15 d后，小鼠左心室扩张，心肌梗死区可见明显的胶原沉积；并且与假手术小鼠心肌组织及心肌远缘区和边缘区相比，心肌梗死区miR-150的表达降低。我们的研究结果与之一致。在本研究中，我们通过生物信息预测miR-150可以调节相关下游基因，其中miR-150和CRP之间存在互补碱基对。而且经过双荧光素酶报告基因分析，miR-150 mimics可以抑制CRP-3′UTR-WT的荧光素酶活性。然而由于CRP属于急性期炎症相关蛋白，有研究显示，在PCI术后48 h内测定CRP对临床结果有显著的预测价值，虽然CRP升高可持续1周，却易受到多种合并症、手术操作、心理应激等外源性因素的干扰，因此在本研究中，虽然LVR组患者血浆CRP水平高于非LVR组患者，但是多因素Logistic回归分析中，CRP并不是LVR发生的独立预测指标。miR-150主要由循环单个核细胞分泌，转移到内皮细胞，并以旁分泌的方式调节其迁移[17]。本研究结果进一步支持了PBMCs中miR-150的相对表达量降低与左心室不利重塑有关。

综上所述，我们发现PCI术后7 d PBMCs中miR-150表达、血浆CK-MB水平和LVEF是1年内发生LVR的独立预测因子。尤其是PBMCs中miR-150表达降低对1年内LVR发生风险的预测价值较高，这可能与其诱导CRP表达上调有关。因此，PBMCs中miR-150有望成为预测LVR发生的新的生物标志物。