猪源肺炎克雷伯氏菌耐药性及毒力基因分析

欧冠标，周雨晴，彭 昊，陆泽宁，廖玉英，马东鑫，袁敬知，葛 强，李 珣，王晓晔

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西壮族自治区兽医研究所，广西南宁 530000；3.南宁市武鸣区双桥镇水产畜牧兽医站，广西南宁 530104）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一种重要的条件性致病菌，常寄生于人和动物的肠道和呼吸道内，可引起肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、子宫炎、乳房炎及其他化脓性炎症，甚至败血症[1-2]。目前已从马、牛、猪、鸡、鹧鸪、鸭和鱼等多种动物体内分离到Kp[3-7]。各年龄阶段的人均可被Kp感染，免疫缺陷者不但易感且易发败血症。Kp广泛存在于自然界的土、水、谷类中。患者和患病动物是其主要传染源，主要通过呼吸道传播。畜禽养殖环境中，家禽及其产品如蛋、肉用鸡及它们所处的环境，可能是人感染Kp的传染源。普通公众感染主要是自身带菌所致的内源性感染，少部分是外源性感染，如医疗器械、静脉注射等的侵入性诊疗措施和医务人员带菌传播。人食物中毒主要通过被Kp污染的食物。

目前，我国对Kp的研究大多在人医方面，而对猪源Kp的研究相对较少。本试验对从广东省佛山市一家屠宰场采集的125份肛拭子和50份猪肉样品，通过细菌分离鉴定、药敏试验、耐药基因及毒力基因检测，探究屠宰前后猪源Kp的分布及相关菌株的生物学特性和耐药性，以期为防控该菌引起的养殖场生猪感染、抗生素耐药性及保障猪肉品质，强化屠宰加工过程中的公共卫生管理提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1肛棉拭子 分3批采集自佛山市某屠宰场存栏待宰生猪。采用消毒棉拭子插入生猪肛门采取粪便，置入装有少量灭菌生理盐水的试管内，并对每管标记编号，4 ℃保存，共125份。样品对应生猪分别来自9个省份，其中福建12份、广东38份、湖南25份、江西28份、吉林8份、辽宁4份、陕西6份、山西2份、黑龙江2份。

1.1.2猪肉样品 采集自该屠宰场屠宰后流水线上的生猪胴体。用灭菌剪子剪取约1 cm×1 cm的肉粒一块，每份肉样装入灭菌离心管内，-20 ℃存储，共50份。样品对应生猪来自6个省份，其中福建8份、江西8份、黑龙江5份、广东12份、辽宁6份、湖南11份。上述肛棉拭子和猪肉采样后做好记录，包括日期、编号、产地等，然后将样品冷冻保存送往广西大学动物医院实验室进行检测分析。

1.1.3主要试剂 麦康凯（MAC）培养基、Luria-Bertani（LB）液体培养基，均购自Oxoid公司；药敏试验抗菌素药粉，购自北京索莱宝科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix聚合酶，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；革兰氏染色液，购自北京索莱宝科技有限公司；试验所用引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细菌分离培养 将采集的样品解冻后，于无菌环境下用接种环蘸取管内液体，划线接种于MAC培养基，37 ℃培养12～16 h；挑取大小一致、粉红色黏液性的单个疑似菌落接种于MAC培养基进行纯化，37 ℃培养12 h；挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检观察；最后接种单个菌落于3 mL LB培养基中，37 ℃过夜培养。

1.2.216S rRNA及体外溶血酵素基因（khe）扩增鉴定

1.2.2.116S rRNA细菌分离纯化后提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用16S rRNA基因序列通用引物（上游引物：5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3'；下游引物：5'-GTTGGCGGACGGGTGAGTAA-3'）进 行PCR扩增。预期扩增片段长度约1 500 bp，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR反应体系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，最后ddH2O补足至25.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个 循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，验证扩增条带。将目的条带切胶回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将分离株16S rRNA基因序列与GenBank数据库收录基因序列进行比对分析。

1.2.2.2khe基因khe基因仅存在于Kp，可作为鉴定的特异性靶标[8]。根据GenBank中khe基因序列（登录号：CP035202.1）设计特异性引物（khe-F：5'-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3'；khe-R：5'-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3'）进行PCR扩增，预期扩增片段长度为489 bp，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR反应体系与16S rRNA扩增体系相同。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3毒力基因扩增 以细菌基因组DNA为模板，对fimH、kfu、aereobactin、wabG、uge等5种毒力基因进行PCR扩增（引物信息见表1）和凝胶电泳分析，比较不同来源菌株毒力基因分布。

表1 毒力基因引物序列信息

1.2.4耐药基因扩增 以细菌基因组DNA为模板，对氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadB，β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaOXA，喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib-cr，四环素类耐药基因tet(A)，酰胺醇类耐药基因floR以及硫酸粘杆菌素耐药基因mcr-1等进行PCR扩增（引物详情见表2）和凝胶电泳分析，比较不同来源菌株耐药基因分布。

表2 耐药基因引物序列信息

1.2.5药敏试验 按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）文件（M100-S21）推荐的微量肉汤稀释法，对分离得到的Kp采用9类12种抗菌药物进行药敏试验，药物均购自Oxoid公司。12种药物分别是，庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）、美罗培南（MEM）、阿莫西林/克拉维酸钾（AMC）、头孢噻肟（CTX）、头孢吡肟（FEP）、头孢西丁（FOX）、环丙沙星（CIP）、氯霉素（CHL）、硫酸粘杆菌素（COL）、四环素（TET）、磷霉素（FOS）。根据CLSI标准判断其耐药性。同时，比较分析不同地区Kp耐药情况。

2 结果与分析

2.1 细菌形态观察

分离纯化后，在MAC琼脂平板上呈现粉红色、中央凸起、表面光滑、大小一致的黏液状菌落（图1-A）；用接种环蘸取菌落，随后向上提起，部分菌落拉动成丝；挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检观察可见单个、成双或链状排列的短粗状革兰氏阴性菌（图1-B）。

图1 MAC琼脂平板上的红色菌落及革兰氏染色镜检结果（100×）

2.2 16S rRNA扩增

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，部分产物扩增出大小约1 540 bp的片段（图2），与预期目的片段大小相同。取16S rRNA PCR产物测序分析，将此基因序列与NCBI GenBank中已有序列进行BLAST比对，发现同源性在99%以上。

图2 分离菌株16S rRNA PCR扩增电泳图

2.3 khe 基因扩增

部分菌株khe基因扩增结果见图3。由图3可知，扩增条带约489 bp，与预期目的条带大小一致。

图3 khe 基因扩增电泳结果

2.4 各地区样品检测情况

经16S rRNA、khe基因扩增，从125份肛棉拭子样品、50份宰后生猪肉类样品中各分离得到32、4株Kp。按采样日期顺序命名为GDKP-1～36（GDKP-1～32分离自肛棉拭子样品，GDKP-33～36分离自猪肉样品）。

由表3可知，在肛棉拭子样品中，共检测出32株Kp，涵盖7个省份，分别为福建（4株，GDKP-6/GDKP-7/GDKP-30/GDKP-31）、广东（8株，GDKP-4/GDKP-5/GDKP-8/GDKP-9/GDKP-14/GDKP-21/GDKP-2 2/G D K P-2 3）、湖南（6株，GDKP-2/GDKP-3/GDKP-11/GDKP-12/GDKP-13/GDKP-20）、江 西（9株，GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-18/GDKP-19/GDKP-24/GDKP-25/GDKP-26/GDKP-32）、吉 林（2株，GDKP-16/GDKP-17）、辽宁（1株，GDKP-29）、陕西（2株，GDKP27/GDKP-28）；猪肉样品中，有3个省份检出4株Kp，分别为江西2株（GDKP-33/GDKP-34）、黑龙江1株（GDKP-35）、福建1株（GDKP-36）。

表3 各地区样品检测情况统计结果

2.5 耐药基因以及毒力基因扩增与分析

从耐药基因扩增结果（表4）来看，36株Kp含耐药基因比例从大到小依次为tet(A)（83.3%）、floR（63.9%）、mcr-1（27.8%）、aadA1（11.1%）、blaTEM、blaOXA和qnrB（均为8.3%）、aac(6')-Ib-cr（5.6%）、blaCTX-M-1（2.8%），其他耐药基因无检出；从毒力基因检测结果（表4）来看，比例从大到小依次为wabG（72.2%）、fimH和uge（均为69.4%）、kfu（63.9%）、aereobactin（19.4%）。耐药基因中，同时携带floR+tet(A)的菌株最多，达23株（占63.9%）；毒力基因中，同时携带kfu+fimH+uge+wabG的菌株最多，达20株（占55.6%）。详细基因型分布见表4和图4。

表4 不同地区肺炎克雷伯氏菌株耐药基因和毒力基因分布

图4 36株肺炎克雷伯氏菌耐药基因和毒力基因分布

2.6 药敏试验

2.6.1耐药性分析 对分离到的36株Kp进行药敏试验，结果见表5。由表5可知，36株Kp对各种抗生素的耐药率介于0～83.3%。其中对TET耐药率最高，为83.3%；对其他抗菌药物的耐药率依次是CHL（63.9%）＞COL（27.8%）＞GEN（11.1%）＞FOX/CIP（8.3%）＞AMC（5.6%）＞CTX（2.8%）。分离株对AMK、MEM、FEP、FOS的耐药率均为0，敏感性相当高。从抗生素大类来看，耐药率依次是四环素类（83.3%）＞酰胺醇类（63.9%）＞多肽类（27.8%）＞喹诺酮类（8.3%）＞氨基糖苷类（0～11.1%）＞β-内酰胺类（0～8.3%）＞碳青霉烯类和其他（0）。

表5 分离株耐药数据分析结果

2.6.2耐药性区域分布 不同地区Kp耐药性结果（表6）显 示：36株Kp中有6株耐受4种抗生素，耐药谱和菌株来源分别为GDKP-6/GDKP-7（FOX+CHL+COL+TET）来源于福建，GDKP-9（AMC+CIP+CHL+TET）和GDKP-23（AMC+FOX+CHL+TET）来源于广东，GDKP-11（GEN+CIP+CHL+TET）和GDKP-13（CTX+CIP+CHL+TET）来源于湖南；有6株耐受3种抗生素，耐药谱和菌株来源分别为GDKP-8（GEN+CHL+TET）来 源于广东，GDKP-24（GEN+CHL+TET）和GDKP-18/GDKP-19/GDKP-26（CHL+COL+TET）来源于江西，GDKP-29（CHL+COL+TET）来源于辽宁；有13株耐受2种抗生素，耐药谱和菌株来源分别为CHL+TET（江西5株：GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-25/GDKP-33；湖南2株：GDKP-2/GDKP-3；广东2株：GDKP-4/GDKP-22；福建1株：GDKP-31；黑龙江1株：GDKP-35）、GEN+TET（陕西1株：GDKP-28）、COL+TET（江西1株：GDKP-32）；有8株耐受1种抗生素，耐药谱和来源分别为TET（广东2株：GDKP-5/GDKP-21；陕西1株：GDKP-27；福建1株：GDKP-30；江西1株：GDKP-34）、COL（广东1株：GDKP-14；湖南1株：GDKP-20；福建1株：GDKP-36）；有3株不耐受药物，分别为湖南1株（GDKP-12）、吉林2株（GDKP-16/GDKP-17）。

表6 不同地区Kp耐药情况分布 单位：株

3 讨论

Kp是医院获得性感染及社区获得性感染中常见的条件致病菌，在由革兰氏阴性菌引起的血流感染中，其分离率仅次于大肠埃希菌[21]。近年来，Kp已成为最重要的条件致病菌之一，并且耐药性逐渐增强[22]。长期以来，人医临床领域对该菌高度重视，但是动物源Kp并未受到广泛关注，关于猪源Kp的报道较少。本试验从某屠宰场待宰生猪125份肛拭子样品和50份宰后猪肉样品中共分离得到36株Kp，检出率为20.57%（36/175），检出率较高。杜琳等[23]对我国部分地区奶牛乳房炎进行分离鉴定，从497份样本中分离得到46株Kp，分离率为9.26%；张聪等[24]对南宁市伴侣动物源Kp检测结果显示，犬、猫的分离率分别为5.26%（3/57）、2.44%（1/41）。杨帆等[25]对医源与动物源Kp耐药性分析发现：医源菌株耐药率显著高于动物源菌株；在动物源菌株中，鸡源和猪源菌株耐药率高于兔源和犬源菌株；除犬源菌株外均表现多重耐药。综上，不同动物源Kp检出率以猪较高，这可能与我国生猪养殖规模大、数量多，生产过程常使用抗生素来促进生长和预防疾病有关，而牛和犬接触抗生素的概率相对较少，所以牛源、犬源菌株耐药率较低。

药敏试验结果显示，36株Kp对AMK、MEM、FEP和FOS耐药率均为0，表明分离菌株对这4种药物非常敏感。分离菌株对TET、CHL耐药率（分别为83.3%和63.9%）较高，对头孢菌素类、青霉素类、氨基糖苷类和喹诺酮类等受试药物耐药性并不严重，导致这一结果的原因可能与养殖期间生猪用药状态有关。在使用抗生素时，一些新合成的、价格昂贵的药物，很少在动物中使用，故对其产生的耐药性较低，如MEM、FEP、FOS等药物在动物中使用可能较少。

多黏菌素被认为是治疗耐碳青霉烯Kp感染联合抗菌疗法的主要抗生素。一些菌株通过脂多糖修饰多黏菌素耐药性，并且这些耐多黏菌素分离株的分离频率逐渐增加[26]。耐药基因检测结果显示，硫酸粘杆菌素耐药基因mcr-1检出率为27.8%（10/36），与张聪等[24]报道的mcr-1检出率呈上升趋势结论一致。超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum β-lactamase，ESBL）是目前已知的细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制[26]，本试验中β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA检出率分别为8.3%、2.8%、8.3%，与细菌耐药表型一致。

毒力基因检测结果发现，参与脂多糖合成的毒力因子wabG携带率（72.2%）最高，其次另一个与脂多糖合成相关的毒力基因uge携带率（69.4%）也超过60%，表明分离菌株携带脂多糖相关毒力因子概率较高。脂多糖通过补体介导所形成的连锁反应，在菌体表面聚集成复合物，从而介导细菌逃避或抵抗宿主天然免疫的杀伤[9]。黏附素是细菌传播定殖的关键因素，检测结果显示黏附素相关毒力因子fimH和kfu携带率（分别为69.4%和63.9%）均超过60%，并且4株来源于宰后猪肉的分离株均携带fimH和kfu，表明携带黏附素毒力因子更易造成细菌传播。

有研究[27]显示，不合理使用抗生素会促进耐药基因传播。虽然屠宰场能有效降低出场猪肉细菌携带率，但不能完全阻断耐药基因传播。因此，科学选择抗生素，交替使用不同类型抗菌药物，避免耐药性产生对于阻止细菌耐药性扩散极为重要。此外，屠宰场应加强屠宰加工环节管理，严格执行加工过程中各项规章制度并规范操作，提高工作人员自身素质和安全卫生意识，降低细菌交叉污染的可能性，确保猪肉品质安全以降低细菌病发生，从而减少经济损失。

本研究共分离到36株Kp，分离菌株对头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类等受试药物表现敏感，而对四环素类、酰氨醇类和多肽类等药物耐药性较高，尤其以TET和CHL较为严重。共检测出9种耐药基因：tet(A)、floR、mcr-1、aadA1、blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA、qnrB和aac(6')-Ib-cr；检测出5种毒力基因：wabG、fimH、uge、kfu和aereobactin。本研究表明，应交替使用不同类型抗菌药物，最大程度避免细菌耐药性产生。同时，屠宰场应加强管理，提高安全卫生意识，降低细菌交叉污染，保障猪肉品质卫生。