雏鸭重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗母源抗体消长规律

覃艳然，王 翠，梁竞臻，韦 钰，王 敏，刘佳佳，谢艳林，蒙文娟，严斯刚，黄小武

（1.柳州市动物疫病预防控制中心，广西柳州 545000；2.融水苗族自治县动物疫病预防控制中心，广西融水 545300）

A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）可引起禽类呼吸器官或全身性感染，早在1901年被分离出。20世纪70年代，人们开始意识到水禽中所携带的AIV是流感病毒的“基因库”[1]。AIV具有多种亚型，其中H5和H7亚型为高致病性。H5和H7亚型AIV不仅能引起家禽的高发病率和高死亡率，造成养殖场巨大经济损失，还会严重危害人类健康，甚至造成死亡。目前，控制禽流感的最有效途径是疫苗免疫。

2017年之前，我国只对家禽进行H5亚型强制免疫，对H7N9亚型不强制免疫。但2017年2月发生的H7N9流感大暴发，不仅危害家禽业，还感染人，严重威胁公共卫生安全。为此2017年秋季，H7亚型禽流感也被列为强制免疫病种，使用重组禽流感（H5+H7）二价灭活疫苗对家禽进行强制免疫。据中国动物疫病预防控制中心报告，强制免疫能有效降低流感在家禽和人之间的流行[2]。AIV不断变异，导致我国流行的AIV保持了多血清型、多基因型、多致病性并存的特点[3]。因此，在多个抗原性毒株共同流行的情况下，需要多价禽流感灭活疫苗。2019年下半年，我国用重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 Re-2株）替换了重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re-1株）。到目前为止，未见关于三价灭活疫苗田间试验母源抗体消长规律的相关报道。由于雏鸭体内母源抗体对疫苗免疫效果有一定的影响，因此本试验对雏鸭禽流感母源抗体的变化规律进行监测，旨在了解雏鸭体内母源抗体消长规律，以期为制定重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗的最佳首次免疫时间提供依据。

1 材料

1.1 诊断试剂

H5亚型AIV（Re-11株和Re-12株）血凝抑制试验抗原，由哈尔滨维科生物技术有限公司提供；H7亚型AIV（Re-2株）血凝抑制试验抗原以及H5亚型AIV（Re-11株、Re-12株）、H7亚型AIV（Re-2株）标准阴阳性血清，由哈尔滨国生生物科技股份有限公司提供；H5亚型AIV（rSD57株、rFJ56株）血凝抑制试验抗原、标准阴阳性血清，均由华南农大生物药品有限公司提供；H5亚型与H7亚型AIV双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，由哈尔滨元亨生物药业有限公司提供。

1.2 主要仪器

微量移液器、V型反应板、微型平板振荡器、荧光PCR仪等。

1.3 实验动物和疫苗

本试验所用的动物均由养殖场提供，所用的两种重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗分别由哈尔滨维科生物技术有限公司和华南农大生物药品有限公司提供。这两种苗均可用于预防由H5亚型2.3.2.1d分支、2.3.4.4d分支和H7亚型AIV引起的禽流感。

2 方法

2.1 试验分组

免疫哈尔滨维科生物技术有限公司的重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 H7-Re-2株、H5N2）的种鸭为A组，免疫华南农大生物药品有限公司的重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N2 rSD57株+rFJ56株、H7N9 rGD76株）的种鸭为B组。对两组种鸭分别在10、55、110日龄注射对应的重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗，370日龄时采集种鸭血清检测抗体，选择抗体水平高的种鸭蛋进行孵化；从A组和B组种鸭蛋刚孵化出的临床健康雏鸭中各选300羽，不注射任何疫苗，在同一饲养场一直饲养到28日龄。

2.2 雏鸭血清样品采集和抗体检测

2.2.1血清样品采集 在雏鸭1、7、14、21和28日龄时，用脚静脉或翅静脉采血的方法，分别从300羽雏鸭中随机抽取100羽雏鸭采血，并分离出血清，-20 ℃保存待检。

2.2.2抗体测定 制备1%的鸡红细胞悬液，通过血凝（HA）试验测定H5亚型Re-11株、Re-12株、rSD57株、rFJ56株和H7亚型（Re-2株、rGD76株）HA抗原效价，根据抗原效价配置血凝抑制（HI）试验需要的四单位病毒，运用四单位病毒通过HI试验检测雏鸭血清中AIV抗体滴度。具体操作方法参考《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003）。

2.2.3结果判定 标准阴性血清对照孔滴度≤2log2，标准阳性血清对照孔误差不超过1个滴度，试验结果成立；样品血清HI效价≥4log2，判为阳性；HI效价＜4log2，判为阴性。

2.3 雏鸭棉拭子样品采集及检测

2.3.1棉拭子采集 用棉签采集100羽1日龄雏鸭喉头与泄殖腔分泌物，然后将棉签放入有保存液的EP管中，-20 ℃保存待检。

2.3.2病原检测 用H5与H7亚型AIV双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行样品RNA提取，配制实时荧光RT-PCR反应体系，通过荧光PCR仪的循环反应，扩增特异片段。详细操作参照试剂盒使用说明书。

2.3.3结果判定 阳性对照Ct ≤30并出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线，试验结果成立。被检样品Ct ≤30并出现特异性扩增曲线，判为阳性；被检样品Ct ≥36，判为阴性；被检样品30 ＜Ct ＜36并出现特异性扩增曲线，需重新抽样提取RNA，扩增后再进行结果判定，如仍是可疑，可判为阳性。

3 结果与分析

3.1 种鸭抗体检测

种鸭在370日龄时AIV血清抗体达到较高水平，各亚型抗体阳性率均在98.89%以上。具体抗体检测结果见表1。

表1 种鸭AIV抗体检测统计结果

3.2 A组雏鸭母源抗体检测

A组雏鸭母源抗体在1、7、14、21和28日龄时的检测结果见表2。各亚型母源抗体在1日龄时平均滴度均达最高水平，且离散程度低；随着日龄增长，各亚型母源抗体水平逐渐下降。尽管7日龄时母源抗体阳性率仍在70%以上，但平均抗体水平已下降到（4.56～4.26）log2。

表2 A组雏鸭AIV母源抗体检测统计结果

3.3 B组雏鸭母源抗体检测

B组雏鸭AIV母源抗体在1、7、14、21和28日龄时检测结果见表3。各亚型母源抗体在1日龄时平均滴度均达最高水平，且离散程度低；随着日龄增长，各亚型母源抗体水平逐渐下降；7日龄时母源抗体对雏鸭还有一定的保护作用，而14日龄时母源抗体阳性率下降至45%～79%，平均抗体水平下降到（3.06～4.23）log2。

表3 B组雏鸭AIV母源抗体检测统计结果

3.4 雏鸭病原检测

在1日龄雏鸭的喉头/泄殖腔棉拭子中，未检测出H5亚型与H7亚型AIV（图1）。

图1 H5与H7亚型AIV双重实时荧光RT-PCR扩增曲线

4 讨论

禽流感目前仍是世界养禽业关注的重点。近年来，H5亚型AIV出现了clade2.2、clade2.3.4、clade2.3.2.1、clade2.3.4.4等分支或亚分支。目前流行的H5亚型AIV主要为clade2.3.4.4和clade2.3.2.1分支毒株，其中优势流行毒株为clade2.3.4.4[3-4]。而2019年投入使用的疫苗（Re-11+Re-12株、rSD57株+rFJ56株）与当前流行毒株抗原特性相匹配，对预防H5亚型禽流感发挥了重要作用。对于H7N9亚型来说，H7N9流感疫情在我国已经暴发多次，引起每次暴发的AIV基因都发生了重组。2017年下半年实施强制免疫后，我国H7N9流感得到了较好的控制，所以对家禽进行免疫接种是预防禽流感暴发的重要途径。但也发现接种疫苗后一些家禽仍可感染发病，其中母源抗体是影响疫苗免疫效果的重要因素之一[5]。在母源抗体较高时接种疫苗，会中和一部分抗原，从而不能产生较好的免疫效果；但接种过晚，会使母源抗体过低或出现抗体空白期，会对家禽健康造成一定威胁。因此，掌握AIV母源抗体消长规律，对家禽科学免疫程序制定具有重要意义。

本试验发现，高抗体水平种鸭孵出的雏鸭，1日龄时其母源抗体水平也较高，平均抗体滴度可达7.27log2以上，从其喉头/泄殖腔棉拭子中也未检出AIV。这说明1日龄雏鸭的抗体为母源抗体，而非感染抗体。因此，在产蛋前有必要对种鸭进行加强免疫，这为出生雏鸭提供强高效保护力起重要作用。

本试验通过对A、B两组雏鸭进行不同日龄AIV母源抗体检测，发现随着日龄增长各亚型母源抗体水平逐渐下降，保护时间在14日龄以内或者更短。这可能与种鸭的免疫程序[6]、疫苗本身所含抗原及饲养环境等因素有关。在1日龄时，A、B两组雏鸭各亚型母源抗体平均滴度分别在7.27log2、7.71log2以上，群体抗体阳性率分别为100%、88%～100%，此时的母源抗体对雏鸭具有很强的保护作用。在7日龄时，A、B组雏鸭各亚型母源抗体平均滴度分别降至（4.56～4.26）log2、（4.93～6.27）log2，且群体抗体阳性率分别降至76%～85%、88%～96%，此时的母源抗体对雏鸭仍有保护作用。而在14日龄时，两组雏鸭母源抗体水平迅速下降，其中：A组群体抗体阳性率下降到21%～25%，且各亚型平均滴度都下降到2.55log2以下，由此得出A组的群体高效保护力在7日龄以内；B组雏鸭群体抗体阳性率下降至45%～79%，且各亚型母源抗体平均滴度都下降到（3.06～4.23）log2，说明B组的群体高效保护力在14日龄以内。到21日龄时，A组雏鸭群体抗体的阳性率已经下降到1%以下，且各亚型母源抗体平均滴度都下降到0.43log2以下，B组群体抗体阳性率下降到13%以下，且各亚型母源抗体平均滴度都下降到1.37log2以下，此时母源抗体已不足以保护鸭群抵御感染风险。当28日龄时，两组雏鸭群体抗体阳性率均以下降到0，且各亚型母源抗体平均滴度也都下降到0，已经是母源抗体空白期。由于首免时疫苗会与母源抗体发生中和反应，降低疫苗免疫效果，因此在母源抗体水平较高时，不应进行疫苗免疫；而当母源抗体降到最低时才进行免疫，会出现免疫空白期，从而增加群体感染风险。综上所述，2种重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗最佳首免时间为7～14日龄。

5 结论

高抗体水平种鸭能够使后代雏鸭具有较高水平的AIV母源抗体，但雏鸭母源抗体保护时间较短；重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗（H5N2 rSD57株+rFJ56株、H7N9 rGD76株）对雏鸭的保护期长于重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 H7 Re-2、H5N2）；两 种重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗最佳首免时间为7～14日龄。