基于网络药理学探讨桑枝降压的作用机制

★ 夏雨 柳婷 龚芬芳 邓碧莲 吴璐 杨华生（江西中医药大学 南昌 330004）

桑枝（Mulberry Twig）为桑科落叶乔木植物桑（Morus albaL.）的干燥嫩枝，味微苦，性平，归肝经，功效“祛风湿，利关节”，主要用于风湿痹证，水肿等。现代药理研究表明，桑枝中主要含有黄酮、生物碱、鞣质等多种活性成分，具有降血糖、降血脂、抗炎等药理作用；同时，临床应用表明，桑枝具有降血压的作用［1］，但物质基础及作用机制尚不明确。

网络药理学是基于系统生物学的理论，阐述药物作用及其作用机制的新技术。网络药理学具有“整体性”“系统性”的特点，而这与中药的作用特点具有一致性，因此，近年来网络药理学在中药研究中得到了广泛的应用。本研究利用网络药理学方法，构建“成分-靶点-通路”网络，初步阐明桑枝降压的作用机制；同时，从网络药理学的角度较全面地把握桑枝降压的活性成分，为桑枝以及含桑枝的药物制剂的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 成分的收集与筛选通过TCMSP（http://tcmspw.com/tcmspsearch.php）、Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org）、化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn）以及中国知网（www.cnki.net）等，以“桑枝”为关键词，查找、收集桑枝的化学成分；以口服生物利用度OB（oral bioavailability, OB）≥20%、类药性DL（Drug-Likeness，DL）≥0.1为限定条件，对所收集到的化学成分进行筛选，得到桑枝活性成分数据库［3］。

1.2 成分靶点库的建立通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），查 找 成 分 的SMILES格 式；使 用Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch）在线分析平台数据库进行检索，删除重复基因，建立成分作用靶点库［3］。

1.3 高血压靶点的获取通过GENE CARDS（https://genealacart.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和CTD数 据 库（http://ctdbase.org/），以“Hypertension”为关键词中进行检索，删除重复基因，建立高血压疾病靶点库［4］。

1.4 PPI分析取“1.2”与“1.3”项下靶点的交集，即为桑枝治疗高血压的靶点；将其上传至STRING数据库，选择“Homo Sapiens”，获得蛋白-蛋白网络图，保存为 TSV 格式文件，利用 Cytoscape 3.7.1软件对核心靶点绘制网络图，获得PPI（proteinprotein interactions, PPI）网络图［4］。

1.5 GO富集和KEGG富集分析通过STRING数据库的GO（Gene Ontology，GO）富集分析，主要包括生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）、细 胞 组 成（cellular component,CC）3个方面的分析；在PM＜0.01的结果中，选择靶点数排名前10的分析结果进行可视化处理。再通过STRING数据库进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析［5］，选择排名前20的分析结果，采用omicshare平台，得到KEGG分析气泡图。

1.6 成分-靶点-通路网络构建根据桑枝化学成分、靶点及通路预测结果，在Excel表格中建立彼此对应关系；导入到 Cytoscape 3.7.1 软件，构建“成分-靶点-通路”网络图［5］。

1.7 分子对接验证利用AutoDock Tools 1.5.6、autodock vina软件对关键靶点与活性成分、硝苯地平（降压阳性对照药）进行分子对接。首先在Pubchem数据库下载桑枝活性成分和阳性对照药硝苯地平的3D结构，利用Open Babel GUI软件将其转换成Pdb格式；导入到AutoDock Tools 1.5.6软件，进行加氢、计算电荷等预处理，并将其保存为pdbqt格式。再从PDB 数据库（https://www.rcsb.org）下载关键蛋白的PDB格式；通过PyMOL软件对关键蛋白进行移除水分子等处理，导入到AutoDock Tools 1.5.6 软件，同样进行加氢、计算电荷等预处理，并将其保存为pdbqt格式。将成分的Pdb、pdbqt格式文件以及关键蛋白的PDB、pdbqt格式文件，导入autodock vina，进行受体-配体对接模拟计算，并利用PyMOL将结果可视化［5］。

2 结果

2.1 桑枝的活性成分基于TCMSP等数据库以及筛选条件，得到桑枝降压的活性成分18个，主要为黄酮类、萜类、生物碱类成分。结果见表1。

表1 桑枝活性成分

（续表）

2.2 桑枝治疗高血压的靶点通过Swiss Target Prediction数据库检索到18个桑枝活性成分作用的靶点336个；通过OMIM、Gene cards数据库检索到高血压相关靶点1 022个。成分靶点与疾病靶点的交集靶点有87个，结果见图1。结果表明，桑枝治疗高血压与桑枝中18个活性成分作用以上87个靶点有关。

图1 桑枝活性成分作用靶点和高血压相关靶点韦恩图

2.3 PPI分析成分与疾病的87个交集靶点的PPI分析的网络图，结果见图2。以degree≥8为条件筛选出14个关键靶点，分别为PIK3CA、APP、PTPN11、MAPK3、AKT1、SRC、EGFR、INS、VEGFA、EDNRA、PTPN1、ADRA1B、IGF1R、ADRB2。

图2 PPI网络图

2.4 GO富集分析GO富集分析得到545个富集条目（P＜0.01），排名前10的结果见图3。其中BP分析获得368个富集条目，主要涉及血压调节、血液循环调节等；CC分析中富集条目76个，靶点主要存在于细胞膜、细胞核等；MF分析中富集条目101个，主要涉及蛋白质结合、信号受体结合等。

图3 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析87个交集靶点共涉及98条通路（P＜0.01），靶点数排名前20的通路见图4，主要涉及cGMP-PKG、Rap1、Ras、PI3K-Akt信号通路。结果表明，桑枝可通过多成分作用多靶点，调节多条通路发挥治疗高血压的作用。

图4 KEGG富集分析气泡图

2.6 “成分-靶点-通路”网络的构建将桑枝活性成分、靶点和通路导入Cytoscape 3.7.1软件中，构建“成分-靶点-通络”网络，结果见图5。该网络共122个节点，其中18个成分节点，87个靶点节点，20个通路节点，434条边。

图5 成分-靶点-通路网络图

2.7 分子对接验证基于“成分-靶点-通路”预测桑枝降压作用机制，进一步采用分子对接对其验证。一般认为配体与受体结合能越低，发生作用的可能性越大。以结合能≤-5 kJ/mol为标准，将筛选出的14个关键靶点与对应的活性成分及硝苯地平进行分子对接，结果见表2。结果显示，阳性药物硝苯地平与14个关键靶点对接的结合能均小于-5 kJ/mol；同时桑枝的活性成分与相应的关键靶点结合后，结合能均小于-5 kJ/mol；将结合能排名前6（结合能≤-8kJ/mol）的分子对接结果进行可视化，见图6。

表2 桑枝活性成分的对接结果

（续表）

图6 分子对接的3D示意图

3 讨论

本研究发现，根据“成分-靶点-通路”网络中degree值排序，桑枝治疗高血压的活性成分可能涉及桑色素、氧化血根碱、槲皮素等活性成分。相关文献表明，桑色素是一种天然的黄酮醇，具有良好的舒血管作用［6］；桑色素还可通过调节NOS抑制剂诱导高血压大鼠肠系膜动脉的Ca2+内流，诱导大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张，从而降低血压［7］。槲皮素也是一种天然的黄酮醇，其可通过改善肠道菌群，减少脂多糖产生，下调TLR4/NFκBp65表达，减轻免疫炎症反应，从而改善血管功能障碍、血管重塑，达到降低血压的作用［8］。氧化血根碱是一种天然生物碱，在心血管系统中，能影响心肌细胞中Ca2+内流，降低心率，诱导心肌细胞凋亡，也可达到降压的作用［9］。

根据KEGG富集结果，桑枝治疗高血压的机制可能与cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt等信号通路密切相关。文献表明，cGMP-PKG信号通路在心血管系统疾病的调节发挥重要作用，NO生物利用度降低是许多心血管疾病的基础，血液流动所产生的剪应力是NO释放是主要决定因素；血管扩张剂NO可以激活cGMP-PKG信号通路，舒张血管平滑肌，扩张血管，降低血压［10-11］。Rap1也可增高NO的生成，达到降压作用［12］。Ras信号通路是机体循环系统中调节血压的主要信号通路，AngⅡ是Ras最重要的活性成分，抑制Ras的激活可使血管局部的AngⅡ浓度下降，从而发挥降压作用［13］。PI3KAkt信号通路是胰岛素调节细胞生理功能的主要信号通路，在信号分子水平上表现为AngⅡ/AT1R信号通路与PI3K/AKt信号通路之间存在串扰，原发性高血压由于Ras的主要效应因子AngⅡ表达上调后抑制胰岛素信号通路PI3K/AKt的活性，打破了其与胰岛素信号之间串扰的平衡，故可通过抑制Ras的过度激活，缓解AngⅡ/AT1R与PI3K/AKt信号通路的失衡状态，降低血压［14］。

总而言之，桑枝降压与其中含有的18个成分作用87个靶点，影响cGMP-PKG、Rap1、Ras、PI3K-Akt信号通路有关，而这18个成分主要是桑色素、槲皮素、桦树酸等。因此，在桑枝药材的质量控制研究中，可以桑色素、槲皮素、桦树酸等为对象，进一步研究这些成分与桑枝减降压作用之间的关系，确定桑枝的质量评价指标；同时，天麻壮骨丸、乐痹康冲剂也含有桑枝［15-16］，本研究结果也可为含桑枝的制剂质量评价提供参考。