银杏叶提取物EGb-761 对乳腺癌肺转移型小鼠体内实体瘤的影响

刘培培，冯赵慧子，严金玲，曾雪亮，潘静，高畅

1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000；2.赣州市人民医院，江西 赣州 341000

乳腺癌是产生于乳腺和导管中的恶性肿瘤，是女性最常见的肿瘤。近年来，乳腺癌的发病率逐渐上升，对女性健康有很大的威胁［1-2］。乳腺癌细胞的远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因；乳腺癌侵袭转移的防治是目前乳腺癌的主要靶点和困难之一。目前，对乳腺癌转移的治疗没有明显的突破，主要用手术治疗、化疗来防止复发转移，然而，化疗具有强烈的毒性，有时甚至加速肿瘤的复发和远距离转移。因此，寻找一种既能预防癌症复发转移，又能减少放化疗毒副作用的抗癌药物迫在眉睫。银杏是新生代第四纪冰川期的残遗植物。世界上超过70%的银杏树在我国生长。EGb-761 是从名贵中药银杏叶中提取的有效活性成分，主要用于治疗认知障碍、血管疾病、肿瘤等等［3-6］。但关于其对乳腺癌实体瘤影响作用的研究和乳腺癌转移的作用尚未见报道，因此本文旨在研究EGb-761 是否对乳腺癌肺转移型小鼠体内实体瘤有影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选取8 周龄健康清洁级雌性BALB/c 小鼠40只，购自重庆医科大学动物实验中心［生产许可证号：SYXK（渝）2002007］，自适应喂养1 周后开始试验。将小鼠随机分为五组，即正常组、模型组、EGb-761 组［高剂量组（200 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）、低剂量组（50 mg/kg）］，每组8 只。

1.2 实验材料

取银杏叶粉碎，加乙醇在70 ℃左右的环境中浸提；再加入用酸调节后的乙醇，过滤、沉淀浓缩液稀释冷却至-1 ℃～20 ℃沉降；上清液用苯乙烯形大孔吸附树脂柱吸附，然后洗脱；洗脱液通过DAD-1 吸附，以提取酸树脂柱；流出液和洗脱液浓缩干燥，以备用。

1.3 实验仪器

银杏叶（当地中药店）、乙醇（上海生工生物工程股份有限公司）、苯乙烯（Sigma-Aldrich 公司）、培养基（美国Gibco 公司）、FBS 缓冲液（Becton-Dickinson 公司）、游标卡尺（南京智睿生物科技有限公司）、天平（海天美天平仪器有限公司）、福尔马林溶液（北京百诺威生物科技有限公司）、解剖显微镜（德国Zeiss 公司）、EP 管、离心管（美国Corning 公司）、异丙醇（北京索莱宝科技有限公司）、离心机（北京白洋离心机有限责任公司）

1.4 方法

1.4.1造模于BALB/c 小鼠第二对乳房右侧皮下接种为 2×105个/只的4T1 乳腺癌细胞，体积约0.1 mL/只，接种前混匀细胞悬液，于4 ℃条件下1 h内完成。移植肿瘤细胞后的第7 天开始，触诊每只造模小鼠注射细胞区域，以判断原位肿瘤是否产生,小鼠饲养约30 d 后即可造成乳腺癌肺转移，每日称量小鼠体质量并记录。

1.4.2观察并测量各组小鼠原位灶实体瘤体积和小鼠体质量各实验组在注射4T1 细胞24 h 后,计算实体瘤体积：每周用游标卡尺测量实体瘤的长、宽，并计算实体瘤体积（cm3）=（长×宽2）/2；计算实体瘤质量/小鼠体质量：取处死后的小鼠原发灶肿瘤，用天平称取实体瘤重，并计算小鼠体质量。

1.4.3观察并计算各组小鼠肺部转移灶结节数、转移率摘取各组小鼠肺部组织，将其放入福尔马林溶液中浸泡 1 个月后，在解剖显微镜下观察并计算其表面肿瘤转移结节数。转移率=模型组中已转移的动物数量（只）/模型组动物总数（只）×100%

1.4.4RT-PCR 法检测各组小鼠CK-19 mRNA 表达将肺组织研磨后将组织转移到EP 管；然后，在4 ℃下，以12 000 g 的速率离心15 min，得到上清液；然后加入异丙醇0.7 mL，混匀，室温10 min；加1.4 mL 75%乙醇混匀；4 ℃，7 000 g 离心5 min，丢弃，在室温下干燥5 min；DEPC 处理灭菌纯水100 μL 溶解，-80 ℃保存，然后进行逆转录反应。

1.5 统计学方法

数据处理采用SPSS 21.0 软件。计量资料以表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠原位灶实体瘤体积和小鼠体质量比较

各组小鼠原位灶实体瘤体积和小鼠体质量比较结果见表1，EGb-761 低、中、高剂量组实体瘤体积均低于模型组，且随着EGb-761 剂量的增加，体积越来越小；EGb-761 低和中、高剂量组的体质量均高于模型组，随着EGb-761 剂量的增加，实验组小鼠体质量呈增加趋势，与模型组比较，中、高剂量组体质量差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组小鼠原位灶实体瘤体积和小鼠体质量比较（）

表1 各组小鼠原位灶实体瘤体积和小鼠体质量比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

2.2 各组小鼠肺部转移灶结节数、转移率比较

各组小鼠肺部转移灶结节数和转移率比较结果如表2，EGb-761 低、中、高剂量组结节数均低于模型组，且随着EGb-761 剂量的增加，肺部结节数也随之减少，与模型组比较，各剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；而随着EGb-761 剂量的增加，肺转移率随之降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠肺部转移灶结节数和肺转移率比较（）

表2 各组小鼠肺部转移灶结节数和肺转移率比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

2.3 各组小鼠CK-19mRNA 表达比较

各组小鼠CK-19mRNA 表达比较结果见表3，EGb-761 低、中、高剂量组分别低于模型组，且随着EGb-761 剂量的增加，各剂量组小鼠肺CK-19 mRNA 表达量越低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠CK-19mRNA表达比较（）

表3 各组小鼠CK-19mRNA表达比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

3 讨论

EGb-761 的提取工艺已非常成熟，国际上常以德国生产工艺为参照标准。银杏叶提取物含有黄酮类化合物、烯醇类、酚类、糖类等活性成分，国内外均有研究表明EGb-761 具有显著抗肿瘤作用［7-8］，其中关于抗乳腺癌作用方面亦有报道［9-10］。乳腺癌细胞转移过程可以大致分为三个阶段:附着力、入侵和迁移。在体内研究中发现，恶性肿瘤向淋巴道和肺组织转移多见，如乳腺癌则常向同侧腋窝淋巴结或肺部转移，造成原发灶与转移灶均有肿瘤或结节产生。4T1 细胞是一类从BALB/c 小鼠乳腺癌细胞中分离出的细胞系，其在小鼠乳房皮下移植后，可形成肿瘤由原位自发地转移至肺、肝、骨髓等器官，因此，实验研究时一般采用BALB/c 小鼠乳腺癌 4T1 高转移细胞株造成乳腺癌转移模型。

在本研究中，EGb-761 低中高剂量组的体瘤体积均低于模型组，而小鼠体质量均高于模型组，说明造模成功；各组小鼠肺部转移灶结节数和转移率结果表明，随着EGb-761 剂量的增加，肺部结节数随之减少，肺部转移率随之降低。这说明，EGb-761 对乳腺癌肺转移有抑制作用。有研究证实，由于CK-l9 在上皮细胞膜上表达，可以作为上皮细胞的标志物，因此它在上皮起源的恶性肿瘤的早期血型转移或微小转移研究中运用较多。肺部恶性肿瘤无论是鳞癌还是腺癌均起源于肺泡上皮细胞，其CK-l9 均有广泛表达，所以在肺癌患者的血中检测CK-l9mRNA 或CK-l9 蛋白的表达可以监测和评估是否存在潜在的肺癌转移风险或肿瘤有无复发［11］。在本次实验中发现，EGb-761 低、中、高剂量组的CK-19mRNA 表达量均低于模型组，且随着EGb-761 剂量的增加，CK-19mRNA 表达量越低。因此推测，EGb-761 可能通过影响CK-19mRNA 表达来抑制乳腺癌的转移。

综上所述，推测银杏叶提取物（EGb-761）可能通过影响CK-19mRNA 表达对乳腺癌肺转移型小鼠体内实体瘤有抑制作用，其机制可能是通过抗血管生成来实现的。这为抑制乳腺癌转移提供了新的研究思路。