紫云英苷诱导DLBCL细胞系OCI-LY8凋亡*

王 瑜，朱明了，何施燕，陈 弘，陈佳玉

（绍兴文理学院医学院，浙江绍兴312000）

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），约占NHL的41%［1］。美罗华+环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松联合用药是目前DLBCL的标准治疗手段，可使患者5年生存率＞71%［2］，但因有明显毒副作用，且＞1/3的患者治疗后会复发［3］，不能实现对DLBCL的完全治疗。对于复发或难治性DLBCL患者，常需干细胞移植，但该法费用贵，供体难寻，排斥率高，有较大风险，且往往只能缓解症状，不能彻底治愈［4］。因此，寻找高效治疗DLBCL的替代药物一直是该领域研究的热点。

紫云英苷（astragalin）属于黄酮类化合物，普遍存在于药用植物中，有抗炎、抗氧化和保护心肌的功能［5-6］。有研究表明，astragalin可通过活化caspase-3而发挥抗黑色素瘤作用［7］，但其抗DLBCL作用尚未见报道。因此，本研究拟观察astragalin对DLBCL细胞系OCI-LY8的作用及其分子机制。

材料和方法

1 实验材料

OCI-LY8细胞为本实验室所保存。清洁级BALB/c小鼠购自于浙江省实验动物中心，动物合格证号为SCXK（沪）2013-0016。Astragalin购自深圳市美荷生物科技有限公司；CCK-8为日本同仁公司产品；Hoechst 33342、BCA蛋白浓度测定试剂盒以及RIPA裂解液（强）均购自上海碧云天公司；AnnexinVFITC/PI双染试剂盒及脱脂奶粉购自BD；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培养液以及胰蛋白酶均购自Gibco；Ⅰ抗和酶标Ⅱ抗购自武汉博士德生物技术公司；RT-qPCR引物源自上海生工生物公司；Trizol和SuperScript®ⅢFirst-Strand Synthesis System购自Invitrogen；ECL化学发光液购自Sigma。

2 方法

2.1 细胞培养用含10%FBS的RPMI-1640细胞培养液，将处于对数生长期的OCI-LY8细胞浓度调节至8×107/L，分别接种于96孔板（每孔100μL）和6孔板（每孔2 mL）中，均置于37℃、5%CO2条件下培养。

2.2 CCK-8法检测OCI-LY8细胞活力取上述96孔培养板，加入astragalin，使其终浓度分别为0、1、5、25和125μg/L，孵育0、24、48和72 h，设3复孔，加入CCK-8溶液每孔10μL，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养3 h，于490 nm波长下经酶标仪检测吸光度（A）值，分析OCI-LY8细胞活力，并作生长曲线。

2.3 Hoechst 33342染色观察OCI-LY8细胞核的变化取上述6孔培养板，加入astragalin，使其终浓度分别为0、5、25和125μg/L，设3复孔，37℃、5%CO2条件下孵育24 h后离心，弃上清，PBS洗3次，用10 μg/L Hoechst 33342染色，室温条件下避光染色10 min，PBS洗3次，加入50μL PBS，荧光倒置显微镜下观察OCI-LY8细胞核变化。

2.4 流式细胞术分析OCI-LY8细胞凋亡率取上述6孔培养板，加入astragalin，使其终浓度分别为0、5、25和125μg/L，设3复孔，继续培养24 h后离心，弃上清，PBS洗2次，用细胞凋亡死亡双染试剂盒染色15 min，PBS洗2次，用流式细胞术分析细胞凋亡和死亡率（试剂用量和染色方法按试剂说明书进行）。

2.5 RT-qPCR检测OCI-LY8细胞内mRNA的转录水平用含有0μg/mL和25μg/m Lastragalin的培养液孵育OCI-LY8细胞24 h，Trizol法提取细胞总RNA，经Nano Drop2000定量后，采用SuperScript®ⅢFirst-Strand Synthesis System逆转录生成cDNA（试剂用量和操作均按说明书进行）。以β-actin为内参，实时荧光定量PCR检测细胞p53、caspase-3、Bax、Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平，经2-ΔΔCt法计算，分析各mRNA的相对水平。引物序列见表1。

2.6 Western blot分析蛋白水平的变化用含有0 μg/L和25μg/L astragalin的培养液分别孵育OCI-LY8细胞24 h，离心弃上清液，用PBS洗3次，加入适量细胞裂解液，提取蛋白，经蛋白定量试剂盒定量后以β-actin为内参照进行Western blot，观察OCI-LY8细胞p53、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达及JAK1、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

2.7 抑瘤实验取4周龄雄性BALB/c小鼠，随机分为6组，每组10只。在无菌条件下饲养1周以适应环境。取对数生长期的DLBCL细胞OCI-LY8，1 000 r/min离心5 min，去上清，PBS清洗3次，完全去上清液，将细胞沉淀并用生理盐水稀释成2×1010/L，于小鼠腹股沟皮下注射0.5 mL细胞悬液。注射3 d后，各组小鼠分别每天灌胃0、5、25、125、625和3 125 μg/kg剂量的astragalin，10 d后杀鼠，取瘤组织称重，分析该药的抑瘤作用。

3 统计学处理

用SPSS 19.0软件处理实验数据。实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间差异的比较用单因素方差分析，以P＜0.05表明差异有统计学意义。

结 果

1 Astragalin抑制OCI-LY8细胞的活力

分别经0、1、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8细胞0 h、24 h、48 h和72 h，结果如图1所示，astragalin能显著抑制OCI-LY8细胞的活力，且作用效果随用药剂量和用药时间的增加而增强。

Figure 1.The results of viability by CCK-8 assay.OCI-LY8 cells were treated with 0，5，25 and 125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μg/L group.图1 CCK-8法检测细胞活力

2 Astragalin导致OCI-LY8细胞核型改变

经0、5、25和125μg/L的astragalin分别作用OCI-LY8细胞24 h，结果如图2所示，经5、25和125 μg/L astragalin作用后的OCI-LY8细胞，出现细胞核染色质浓集、核碎裂现象，形成凋亡小体，且作用效果随用药剂量的增加而增强。

3 Astragalin上调OCI-LY8细胞的细胞凋亡水平

分别经0、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8细胞24 h，流式细胞术检测结果显示，astragalin可诱导OCI-LY8细胞凋亡，且作用效果随用药剂量的增加而增加（P＜0.01），见图3。

4 Astragalin改变OCI-LY8细胞各基因的mRNA水平

经25μg/L astragalin作用OCI-LY8细胞24h后，RT-qPCR检测结果显示，细胞内p53、caspase-3和Bax的mRNA水平显著上调，而Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平显著下降（P＜0.01），见图4。

Figure 3.The results of apoptotic rate examined by flow cytometry.OCI-LY8 cells were treated with 0～125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.图3 流式细胞术检测细胞凋亡率的结果

5 Astragalin改变OCI-LY8细胞的蛋白水平

经25μg/L astragalin作用OCI-LY8细胞24h后，Western blot检测结果显示，astragalin可显著上调OCI-LY8细胞内p53、caspase-3和Bax蛋白水平，并下调蛋白Bcl-2的蛋白水平及JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平，见图5。

6 Astragalin抑制DLBCL生长

抑瘤实验结果显示，astragalin可显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，且作用效果随用药剂量的增加而增强（P＜0.01），见图6。

讨 论

JAK/STAT信号通路主要由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK以及转录因子STAT三组分构成［8］，近年来越来越多的资料证实，该信号通路可作为肿瘤治疗药物的靶点［9-11］。研究表明，JAK1和JAK2在经某种外界刺激后的磷酸化水平受抑，而活性降低的JAK1和JAK2可抑制STAT3蛋白在细胞内募集，并下调STAT3蛋白活性［12-13］，p-STAT3下降可改变线粒体跨膜蛋白，导致Bax与Bcl-2同源二聚体比例增加，增强线粒体膜的通透性，诱导细胞色素C自线粒体中释放出来，上调凋亡终末效应分子caspase-3的表达水平，促进肿瘤细胞发生凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用［12-13］。

Figure 4.The results of RT-qPCR.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.图4 RT-qPCR检测结果

Figure 5.The results of Western blot.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/L group.图5 Western blot检测结果

本实验将astragalin作用于DLBCL细胞OCILY8，经CCK-8法、Hoechst 33342染色和流式细胞术证实，astragalin可抑制OCI-LY8细胞活力并诱导其凋亡。同时RT-qPCR以及Western blot实验结果显示，细胞内p53、caspase-3和Bax蛋白水平显著上调，Bcl-2蛋白含量及JAK1、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平显著下降，因此，astragalin可抑制JAK/STAT信号通路的活化。同时当astragalin作用于OCI-LY8细胞后，p53蛋白水平显著上调。p53是一种抑癌基因，它不仅可以激活Fas和TNF介导的外源性凋亡途径，同时能激活线粒体途径来诱导肿瘤细胞发生凋亡［14-15］。故而，在本研究中p53协同JAK/STAT信号通路发挥着抗DLBCL细胞OCI-LY8的作用。此外，小鼠抑瘤实验也进一步证实astragalin的抑癌作用。

Figure6.The results of tumor inhibiting experiment.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs0μg/kg group.图6 荷瘤小鼠抑瘤实验检测结果

综上所述，astragalin可通过上调p53的表达和影响JAK/STAT信号通路，来抑制DLBCL细胞OCI-LY8活力，并诱导其发生凋亡，为抗DLBCL替代药物的研发提供了重要依据。