角倍蚜各虫态蜡腺的分布与结构

魏洪媛, 丰国蕊, 许 鑫, 邵淑霞, 陈晓鸣, 杨子祥

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所, 国家林业和草原局资源昆虫培育与利用重点实验室, 昆明 650224)

角倍蚜Schlechtendaliachinensis属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)瘿绵蚜亚科(Eriosomatinae)五节根蚜族(Fordini)倍蚜属Schlechtendalia(张广学和陈小琳, 1999; Blackman and Eastop, 2007)，是五倍子的主要生产种，其在盐肤木Rhuschinensis上寄生形成的虫瘿称为角倍，约占五倍子总产量的70%，具有重要的经济价值(张宗和, 1991; 杨子祥, 2011)。角倍蚜具有多种虫型和复杂的生活史，包括有性生殖与孤雌生殖的繁殖方式及两种寄主植物的转主交替寄生。每年3月初，越冬若蚜在侧枝匐灯藓Plagiomniummaximoviczii等冬寄主上羽化为春迁蚜，迁飞到附近的盐肤木树干上，产雌雄性蚜，交配后的雌性蚜产干母，1龄干母沿着树干爬到梢头嫩叶上取食，刺激叶片细胞增生包裹自身形成虫瘿；4～5 d后干母在虫瘿内蜕皮，变成2龄干母，继续发育并经历3次蜕皮后发育成4龄成蚜。于6月中下旬产生干雌，虫瘿在干母和干雌的取食刺激下继续生长；秋季，干雌发育成有翅秋迁蚜，虫瘿爆裂后迁飞到附近的冬寄主藓上产若蚜越冬；次年春季，越冬若蚜发育成有翅春迁蚜，开始新的生活史循环(杨子祥, 2011; 邵淑霞等, 2012)。角倍蚜各虫态均分泌蜡粉，以适合复杂多变的生活微环境，其中干雌和越冬若蚜分泌的蜡粉最多，蜡粉具有防水、保温和防止病原菌寄生等功能(Weietal., 2020)。

昆虫纲中半翅目、鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等的部分种类也分泌蜡粉，其主要作用是在虫体或卵的表面形成保护层，保护昆虫免受雨水、病原微生物和天敌等危害(Chen and Qiao, 2012; 李嘉乐等, 2018)。蜡粉变化最丰富的是半翅目的蚜总科、蚧总科和蜡蝉总科，不同种类的蜡腺分布、发育程度、形状和结构等各不相同(Pope, 1983; Andrea and Emanuele, 2004; Qietal., 2019)；同一种类蜡腺的结构和分布也随着生存环境的不同而存在差异，如苹果绵蚜Eriosomalanigerum的蜡粉分泌量随着龄期的增加而增多，其寄生天敌的发生率随着龄期增加而降低(Suetal., 2016)。

前人对角倍蚜的研究主要包括角倍蚜的生物学特性、生活史及其与寄主植物的相互作用等，但关于角倍蚜蜡腺的研究较少。本研究利用光学和电子显微技术对角倍蚜各虫态蜡腺的分布和超微结构进行观察，分析各虫态蜡腺的差异，探讨蜡腺在角倍蚜生态环境适应中的功能，为角倍蚜基础生物学研究和人工培育技术的改进提供依据。

1 材料与方法

1.1 试虫

角倍蚜于2019年采集自云南省盐津县五倍子蚜培育基地(28°06′N, 104°22′E, 海拔980 m)， 10月初从成熟爆裂的虫瘿中采集有翅秋迁蚜，转移到侧枝匐灯藓藓圃上培育，让秋迁蚜在藓枝上产下若蚜；次年2-3月从藓层中收集越冬若蚜和有翅春迁蚜，并将春迁蚜置于室内培养，获得雌雄性蚜，待雌雄性蚜交配后，收集产下的1龄干母。让干母在盐肤木叶片上取食形成虫瘿，收集瘿内的各龄干母和干雌。

1.2 光学显微镜观察

采用Keyence VHX-1000数码显微系统或Olympus SZX16体式显微镜观察瘿内外各虫态的蜡粉、藓枝上蜡球的结构和自然形态等，并拍照。

将各虫态角倍蚜(每个虫态15头)，置于2.5%戊二醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.2)中固定12 h，转至1%的四氧化锇中固定2 h，经丙酮分级脱水后，包埋在环氧树脂Araldite中；用Leica EM UC6超薄切片机制作成1 μm的半薄切片，用甲基苯胺蓝和劳氏紫Thionin染色，采用Olympus BX-51显微镜观察蜡腺结构并拍照。

1.3 透射电子显微镜观察

将各虫态角倍蚜(每个虫态15头)头部切下，取虫体部分置于2.5%戊二醛和磷酸钠缓冲液中固定12 h，转移至1%四氧化锇冷溶液中固定12 h，经丙酮分级脱水后，包埋于环氧树脂Araldite中；用Leica EM UC6超薄切片机制作成70 nm的切片，用柠檬酸铅和醋酸铀酰双重染色，采用Zeiss EM900透射电子显微镜观察蜡腺结构并拍照。

1.4 扫描电子显微镜观察

在Olympus SZ61体视显微镜下对各虫态蚜虫表面的附着物进行清理，将清理干净的蚜虫分为2组，每组15头。 第1组直接置于Hitachi TM3000扫描电子显微镜下，观察虫体上蜡腺的数量和排列方式；第2组用70%， 80%， 90%， 95%和100%的乙醇依次进行脱水，滤纸吸干；用导电胶将虫体粘在样品台上，用Hitachi JS-1600离子溅射仪喷金，置于Hitachi TM3000电子显微镜下观察蜡腺的结构并拍照。

2 结果

2.1 角倍蚜各虫态蜡腺的数量和分布

角倍蚜所有6种虫态(1龄干母除外)均有蜡腺，蜡腺纵向排列于虫体背部，沿背部中线左右对称分布，其中头部2列2排、胸部4列1排、腹部6列8排(图1: A, B, C)，共56个蜡腺。干母比较特殊，1龄干母没有蜡腺(图2: A)，2龄干母开始具有蜡腺，在腹部背面沿边缘排列，有2列8排，共16个蜡腺，头部和胸部背面没有蜡腺(图2: B)。

2.2 角倍蚜各虫态蜡腺的结构

进一步观察蜡腺的显微结构，发现每个蜡腺由数量不等(2～22个)的多边形凹陷组成，每个蜡腺附近通常伴生有1～2根感觉毛(图2: B, C, D)。在所有6个虫态中，干雌、春迁蚜和秋迁蚜的蜡腺复杂，每个蜡腺由10～14个凹陷组成，且虫体各部位的蜡腺结构没有明显差异(图2: C, D)；越冬若蚜蜡腺的复杂程度次之，每个蜡腺由7～10个凹陷组成，虫体各部位的蜡腺结构没有明显差异(图2: E)；性蚜各部位的蜡腺结构差异显著，靠近背板中线的脊柱板和胸膜板的蜡腺结构简单，由3～5个凹陷组成，而靠近边缘线上的蜡腺结构复杂，由10～22个凹陷组成(图2: F)；1龄干母没有蜡腺(图2: A)，2龄干母虫体边缘有蜡腺，由10多个凹陷组成，但蜡腺较其他虫态小(图2: B)。

2.3 角倍蚜蜡腺细胞的超微结构

超薄切片显示，组成蜡腺的每个凹陷下对应一个分泌细胞，由直接特化的表皮覆盖，没有导管或者导管细胞。分泌细胞的顶端分化出微绒毛，在微绒毛与特化的表皮之间形成储液囊，蜡腺细胞间通过间隙连接(图3: A)。分泌细胞中含有大量的线粒体与粗面内质网，顶端微绒毛里含有大量的光面内质网(图3: B, C)。

图1 角倍蚜蜡腺的分布Fig. 1 The distribution of wax glands in the horned gall aphid, Schlechtendalia chinensisA: 角倍蚜蜡腺分布图(虫体图仿张宗和, 1991)Wax gland distribution in the horned gall aphids (Aphid body diagram was imitated from Zhang, 1991); B： 虫体背面的蜡腺纵切图Wax glands of dorsal line by longitudinal section; C: 虫体侧面横切图Wax gland of lateral line by transverse section; D: 单个蜡腺的半薄切片纵切图Single wax gland by semithin longitudinal section; E: 单个蜡腺的半薄切片横切图Single wax gland by semithin transverse section. mv: 微绒毛Microvilli; pd: 多边形凹陷Polygonal depression; c: 单个蜡腺细胞Single wax gland cell.箭头指蜡腺Arrows indicate wax glands.

图2 扫描电镜观察的角倍蚜各虫态蜡腺的形态和结构Fig. 2 Morphology and structure of wax glands in various body forms of the horned gall aphid,Schlechtendalia chinensis observed using scanning electron microscopeA: 1龄干母1st instar fundatrix; B: 2龄干母2nd instar fundatrix; C: 干雌Fundatrigeniae; D: 秋迁蚜Fundatrispuriae; E: 越冬若蚜Apterae; F: 雄性蚜Sexual male. 箭头示蜡腺。Arrows indicate the wax glands.

图3 透射电镜观察的角倍蚜蜡腺的超微结构Fig. 3 Ultrastructure of wax glands of the horned gall aphid, Schlechtendalia chinensisobserved using transmission electron microscopeA: 蜡腺Wax gland; B: 角倍蚜蜡腺细胞内微绒毛(mv)中有大量的光面内质网(SER)Apical microvilli (mv) of wax gland cell with lots of smooth endoplasmic reticulum (SER); C: 蜡腺细胞间的连接方式——间隔连接Intercellular junction of wax gland by separate junction. pd: 多边形凹陷Polygonal depression; ss: 表皮下空间Subcuticular space; mv: 微绒毛Microvilli; N: 细胞核Nucleus; v: 分泌物囊泡Secretion vesicles; mi: 线粒体Mitochondria; sj: 间隔连接Separate junction.

图4 不同生态环境中的角倍蚜各虫态的照片和蜡粉分布Fig. 4 Photographs and wax distribution of various body forms of Schlechtendalia chinensisliving in different ecological environmentsA: 1龄干母1st instar fundatrix; B: 干雌，瘿内的干雌和蜡粉包裹蜜露形成的蜡球(wb)Fundatrigeniae and a large wax ball (wb) formed by wax wrapping honeydew in a gall; C: 秋迁蚜，虫瘿内的有翅秋迁蚜和蜡粉Fundatrispuriae with wax in a gall; D: 越冬若蚜，藓上被蜡粉包裹的越冬若蚜Apterae with wax in mosses; E: 性蚜，体表有蜡粉Sexual forms with wax on the body surface; F: 2龄干母，虫瘿内蜕皮后的干母、蜡粉和蜕2nd instar fundatrix after molting, wax and exuviae in a gall.

2.4 角倍蚜各虫态蜡粉的数量和分布

除1龄干母外(图4: A)，角倍蚜各虫态的体表均有蜡粉，其中干雌、春迁蚜和秋迁蚜分泌的蜡粉最多，瘿内干雌分泌大量蜡粉，包裹虫体，脱落的蜡粉包裹蜜露、蜕等，有时甚至在瘿内形成大的蜡粉球(图4: B)，迁飞前的秋迁蚜，虫体间有大量的蜡粉(图4: C)；越冬若蚜分泌蜡粉次之，蜡粉包裹自身，在藓枝上形成松散的蜡球(图4: D)；性蚜的蜡粉比越冬若蚜少(图4: E)，没有包裹虫体；干母比较特殊，1龄干母(瘿外)虫体黑色、细长，体表光滑，没有蜡粉(图4: A)，2龄干母(瘿内)虫体淡黄色、短粗，体表有少量蜡粉(图4: F)。

3 讨论

3.1 角倍蚜各虫态蜡腺的结构变化及其对生活微环境的适应

蚜虫分泌的蜡粉具有良好的防水功能，对于在潮湿或寒冷环境中生活的蚜虫来说更加重要。绿色云杉蚜Elatobiumabietinum可以在冬季经历几次霜冻，是因为其表面丰富的蜡粉可以防止水分在虫体表面凝固从而起到保护作用(Powell and Parry, 1976)。角倍蚜蜡腺结构、形态和凹陷数量等在不同虫态及同一虫态的不同部位间差异显著，其复杂程度与生活微环境密切相关，是角倍蚜对环境条件长期适应的结果。角倍蚜干雌生活在完全封闭的虫瘿内，相对湿度接近100%(刘平, 2014)，发达的蜡腺分泌大量的蜡粉，可以有效防止水汽在体表凝结和虫体粘连。春迁蚜需要从贴近地面的潮湿藓层中迁飞到盐肤木树干上，秋迁蚜需要从虫瘿裂口处迁飞到潮湿的藓层中(邱明生和赵志模, 1995; 赖永祺等, 1986)，发达而均匀的蜡腺分泌蜡粉(图4: C)，可以帮助保持体表干燥，有利于成功迁飞。越冬若蚜生活在贴近地面的高湿度的藓层中，发达的蜡腺分泌大量蜡粉包裹虫体(图4: D)，可以有效隔离雨水和防止水汽在体表凝结，度过寒冷的冬季。有研究表明，与形成蜡球的角倍蚜个体相比较，未形成蜡球的个体死亡率较高(赖永祺等, 1990)。

性蚜由迁飞到盐肤木树干的春迁蚜在3月中上旬繁殖产生，在湿度较高的树皮缝内爬行、交配并隐蔽生活(唐觉和张传溪, 1987)，虫体背部边缘线上蜡腺的复杂程度要远远高于脊柱板和胸膜板上的蜡腺，因此虫体的边缘较背面分布有更多的蜡粉(图4: E)，这可能是因为性蚜在潮湿的树干表面爬行，边缘线上发达的蜡腺分泌较多的蜡粉可以隔离树干表面的水。交配后的雌性蚜在盐肤木树干上繁殖产干母，1龄干母必须在1～2 d内沿树干爬到新萌发的嫩叶上取食，刺激叶片组织增生并形成虫瘿包裹自身，在瘿内继续取食并蜕皮，完成从瘿外到瘿内的转变；1龄干母需要快速爬行到梢头寻找嫩叶取食(唐翊峰, 2014)，蜡粉会影响其快速爬行，因此其蜡腺缺失或退化；当干母被包裹进封闭的虫瘿内后，为适应瘿内高湿度的微环境，干母蜕皮后出现蜡腺，分泌蜡粉防止水汽在体表凝结，保证了其正常的生存和繁殖。因此，干母在个体发育中蜡腺的从无到有，正是干母对从瘿外到瘿内的微环境变化的适应。

可以看出，经过长期的进化，角倍蚜各虫态均具有与其生活微环境相适应的蜡腺结构，保证了种群的繁衍，但仍存在一些薄弱环节。如1龄干母没有蜡腺，不能分泌蜡粉，如遇到初春的连续阴雨，将会由于缺乏蜡粉的保护而大量死亡；此外，秋季在藓上初产的越冬若蚜，如遭遇阴雨，也会由于蜡粉分泌不足和蜡球未完成形成而死亡。因此，在角倍蚜培育过程中，可以有针对性地研发或改进培育技术，如通过积温调控干母发生时间，在藓圃上覆盖薄膜等，避开早春和晚秋的阴雨，可以有效降低初产干母和越冬若蚜的死亡率，提高五倍子产量。

3.2 角倍蚜蜡腺细胞的超微结构与功能

昆虫的外分泌腺细胞根据表皮结构和分泌物的分泌方式可以分为class 1和class 3，属于class 1的腺体细胞被表皮细胞覆盖，分泌物需要穿过表皮；而属于class 3的腺体细胞与导管相连，分泌物通过导管到达细胞外(Noirot and Quennedey, 1974)。角倍蚜蜡腺细胞被表皮细胞覆盖，蜡的分泌必须穿过表皮这个屏障，表明角倍蚜蜡腺分泌细胞属于class 1(图3: A)；蜡腺细胞中和顶端微绒毛中存在大量的光面内质网，其作用是将脂类分泌物带到微绒毛，然后通过微绒毛分泌，微绒毛增加了蜡腺细胞的面积，提高了分泌效率(Wangetal., 2018)。蜡腺细胞中存在大量的线粒体，可能是为蜡的分泌提供能量(Billenetal., 2017)。

3.3 角倍蚜蜡粉在瘿内封闭微环境中的保护功能

蚜虫通过刺吸式口器取食植物汁液，食物中多余的大量含糖液体以蜜露的形式被排出。自由生长的蚜虫通常排放大量的蜜露(Stadler and Müller, 1996)，一些生活在半封闭虫瘿内的蚜虫可以将蜜露、蜡粉和蜕等从开口处排出(Smith, 1999)。但角倍蚜大量的干雌(通常每个虫瘿内5 000～8 000头)生活在完全封闭的虫瘿内长达150多天(Shaoetal., 2013; 陆沁等, 2018)，其排泄的大量蜜露是如何处理的呢？最新的研究表明角倍蚜虫瘿内壁可以将蜜露吸收和再利用，成为虫瘿生长的营养来源之一(Chenetal., 2020)。除此之外，角倍蚜瘿内干雌发达的蜡腺分泌大量的蜡粉，可以将多余的蜜露和蜕等包裹，形成较大的蜡球(图4: B)，有效地防止蜜露的污染和虫体间的粘连。虫瘿的生长期为每年5-10月，跨越最热的夏季，瘿内的高湿、高温、封闭的环境和高糖的蜜露，具备了病原菌发生的良好条件，瘿内大量的蜡粉，还可以有效防止病原菌孢子萌发和菌丝生长(Pikeetal., 2002)，保证了瘿内角倍蚜种群的正常生长和繁殖。前人的研究也证明山毛榉蚜Phyllaphisfagi分泌的蜡粉可以防止黑色霉菌的发生(Smith, 1999)。

综上所述，角倍蚜蜡粉的主要功能是防水和包裹蜜露等，各虫态蜡腺的数量、排列和发达程度与其生活微环境和各虫态的生物学特性密切相关，这些特征可能是角倍蚜对环境条件长期适应的结果。随着角倍蚜全基因组的发布，联合基因组、转录组和蛋白质组学数据鉴定角倍蚜的泌蜡基因，分析泌蜡基因在各个虫态间的表达差异，将有助于从分子层面揭示角倍蚜蜡腺在环境适应和进化中的生态学意义。