致病性大肠杆菌致结肠癌细胞微绒毛损伤的毒力分子研究

周诗璞，林华，杨健

(1.通江县人民医院感染科，四川 巴中 636700；2.四川省出入境检验检疫技术中心，四川 成都 610041；3.川北医学院基础医学院，四川 南充 637000)

致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)是发展中国家引起婴幼儿腹泻的一个重要病原体[1-2]，EPEC感染宿主细胞典型的改变是：细菌先黏附宿主上皮细胞，接着在细菌黏附的地方有基垫形成，最后造成小肠上皮细胞微绒毛脱落损伤，整个病理过程简称为黏附、脱落损伤(attaching and effacing lesion，A/E)。近年来，对EPEC的致病机制的研究发现：EPEC是通过自身编码表达的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS)向宿主细胞注入毒力分子(比如外膜蛋白受体Tir、分泌蛋白EspF、Map等)发挥相应的生物学效应，尽管对EPEC的致病机制研究取得了较大的进展，但对EPEC参与宿主上皮细胞微绒毛损伤的效应分子仍未清楚[3]，本研究用EPEC多种效应分子删除株感染极化培养的结肠上皮肿瘤细胞TC-7，用扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)检测细菌黏附和微绒毛脱落损伤，以探讨参与细菌黏附和微绒毛损伤的效应分子。

1 材料方法

1.1 材料

菌株、细胞和质粒EPEC野生型(2348/69)、EPEC T3SS删除株(Δcfm-14)、EPEC束状菌毛删除株(ΔbfpA)、EPEC外膜蛋白删除株(Δeae)、EPEC外膜蛋白转位受体删除株(Δtir)、效应分子Map和EspF联合缺失株(Δmap espF)、效应分子Map缺失株(Δmap)等由英国纽卡斯尔大学Brendan Kenny教授惠赠，TC-7细胞由本实验室保存、质粒pACYC184-espF、pACYC184-bfpA、pACYC184-tir和pACYC184-intimin由本实验室构建保存。

试剂和仪器细胞培养基DMEM购自Invitrogen公司，电转仪购自BIO-RAD公司，PCR试剂盒购自大连宝生物有限责任公司，扫描电镜购自英国Cambridge公司，生物安全柜购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 TC-7细胞培养与感染 TC-7 细胞生长DMEM中(含2 mmol/L的谷氨酰胺，1%的非必须氨基酸，10%加热灭活的胎牛血清)，待细胞长满培养瓶，消化细胞，并按1∶1稀释接种细胞到Transwell小室中，持续培养20 d，使细胞极化(在此期间，每两天换细胞基底侧和刷状缘侧培养液各1次)，感染前2～3 h，用37 ℃预热的DMEM洗涤细胞。

1.2.2 质粒转染 用冰冷蒸馏水洗涤EPEC基因删除株3次以制备感受态细胞，-80 ℃保存备用。电转前，取1 μL质粒和感受态细胞相混合，冰上孵育30 min，用电穿孔方式转染EPEC(1 500 v 5 ms)，把细菌均匀涂布含有25 μg/mL氯霉素的平板上筛选转化子，并用PCR鉴定转化子，PCR阳性的转化子用于进一步的感染实验。

1.2.3 SEM检测束状菌毛在EPEC黏附中的作用 实验分为未感染组、ΔbfpA感染组、ΔbfpA/pACYC184-bfpA感染组和EPEC野毒株感染组，分别接种细菌到含有25 μg/mL氯霉素的LB培养液中，静置于37 ℃培养过夜；次日，接种10 μL过夜培养物到2 mL无血清的DMEM培养液中于37 ℃、5%CO2的孵箱诱导培养3 h ；吸出Transwell小室中培养液，加入500 μL诱导后的细菌感染TC-7细胞，于37 ℃，5%CO2感染2 h；用预热的PBS洗涤细胞4次，以清除游离的细菌；用2.5%多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合液于4 ℃固定细胞过夜；弃去固定液体，并逐级脱水：顺序用20%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脱水5 min，标本临界点干燥，喷金，SEM检测细菌的黏附，菌落的形成以及微绒毛的脱落。

1.2.4 SEM检T3SS在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 分别用T3SS删除株Δcfm-14、EPEC野生型感染极化的TC-7细胞，并以未感染组做实验对照，感染方法同前，并于感染的15 min、30 min、60 min用SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。

1.2.5 SEM检测Tir和intimin在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 同样方法用Δeae删除株、Δtir删除株、Δeae/pACYC184-intimin和Δtir/pACYC184-tir互补株感染TC-7细胞2 h，SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。

1.2.6 SEM检测Map和EspF在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 同样的方法用ΔespF、Δmap espF、Δmap删除株以及Δmap espF/pACYC184-espF互补株感染TC-7细胞2 h，SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。

2 结果

2.1 BfpA在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用

经20 d极化培养，TC-7细胞表面可见大量的微绒毛覆盖，微绒毛整齐，致密；EPEC野毒株感染2 h，可见细菌大量紧密黏附在细胞表面，菌落比较致密而扁平，微绒毛变得紊乱并大量脱落；当用ΔbfpA感染时，可见极小量的细菌黏附在上皮细胞表面，上皮细胞微绒毛完整，没有明显微绒毛脱落；当用相应质粒补充BfpA表达以后，突变株恢复到野生型相似的表型(图1)。

2.2 T3SS在细菌黏附及微绒毛损伤的作用

当用EPEC野毒株感染，在15 min时可看见大量细菌黏附在细胞表面，菌落呈球形，成局限性黏附，在感染30 min可观察到细菌仍局限性黏附在细胞表面，但在感染1 h，细菌呈扁平而致密的方式紧密黏附在细胞表面，并且伴随大量微绒毛脱落损伤；而Δcfm-14即使到感染后2 h，细菌仍然成局限性黏附的形式，可以观察到微绒毛略显紊乱，但无显著的微绒毛脱落损伤(图2)。

2.3 外膜蛋白intimin及其受体Tir在细菌黏附及微绒毛损伤中作用

当用Δtir或Δeae删除株感染TC-7细胞，可见：细胞皆局限性黏附在细胞表面，且大量的微绒毛脱落，而EPEC野毒株感染后形成平坦而紧密的菌落；但当用质粒补充Intimin和Tir表达，Δtir或Δeae可以分别恢复到野毒株相似的表型特征(图3)。

2.4 效应分子EspF和Map在黏附及微绒毛损伤中作用

当用ΔespF、Δmap、Δmap espF等删除株感染细胞发现，Δmap能引起与野生型相似的黏附脱落损伤表型，而ΔespF和Δmap espF感染细胞后，可以观察到微绒毛紊乱，而且可以明显观察到细菌嵌入微绒毛丛中，但微绒毛损伤明显比野毒株轻微，当用质粒补充表达EspF后，ΔespF恢复到野生型相似的表型(图4)。

3 讨论

TC-7细胞是从结肠癌Caco-2细胞克隆的一个细胞株，主要用于物质转运、屏障功能和刷状缘微绒毛等研究[4]。EPEC既不产毒素，也不侵袭肠黏膜上皮细胞的肠道致病菌，其致病主要靠其携带的LEE基因编码效应分子转位到宿主细胞引起细胞病变[5]。Cleary等[6-7]报道：细菌的黏附是EPEC感染宿主细胞的第一步，束状菌毛(bundle forming pili，BFP)与细菌黏附高度相关。为了进一步探讨BFP的作用，本研究采用ΔbfpA(删除菌毛的重要亚单位BfpA)感染TC-7细胞。SEM检测发现：该删除株只有少数几个细菌黏附到宿主细胞表面，与野生型EPEC感染形成鲜明对比，当用质粒补充表达BfpA后，恢复了ΔbfpA的表型，充分表明BFP是细菌黏附的重要器官[8]，同时表明：BfpA是BFP的重要亚单位结构。

Tir是外膜蛋白Intimin的转位受体，Tir被转位以后，被宿主细胞的蛋白激酶修饰以后插入到宿主细胞的细胞膜，通过其胞外区和Intimin结合，从而细胞紧密黏附到宿主细胞表面[9]。Humberto等[7]和Ferreira等[10]用细胞为模型研究发现：当用Intimin抗体处理细菌以后，细菌的黏附功能显著下降，表明Intimin是细菌的另一个重要的黏附分子，我们用Δtir和Δintimin突变株感染细胞，SEM检测发现两个突变株细菌都可以大量黏附宿主细胞，但呈局限性黏附，意想不到的是：它们引起比野生型更严重的微绒毛脱落损伤，当用质粒补充表达Tir和Intimin以后，Δtir和Δintimin恢复到野生型的紧密黏附表型，表明Tir和Intimin的结合是细菌紧密黏附的关键。对于微绒毛损伤，推测Tir和Intimin的结合起保护作用，与细菌维持持续感染有关系[11]，Δtir和Δintimin感染时，由于Tir和Intimin不能结合，反而加重了微绒毛的破坏。当用其它效应分子删除株感染细胞，可以观察到：ΔespF删除株感染时微绒毛损伤明显较野生型引起的轻微，但有大量细菌黏附以及陷入微绒毛丛，但用质粒补充表达EspF以后，ΔespF恢复到野生型的表型，表明EspF在微绒毛的损伤中扮演重要的角色；而Δmap espF双删除株感染组具有和ΔespF删除株感染组相似的表型，而Δmap感染组具有和野生型感染组相似的表型，进一步表明EspF在微绒毛的损伤中其重要作用。关于EspF的研究还发现：EspF可以改变细胞间的紧密连接，破坏细胞的屏障结构[12]；EspF还可以定位于宿主细胞线粒体，破坏线粒体功能，从而诱导细胞凋亡[13]，这些结果充分表明：EspF是EPEC感染过程中的关键的毒力分子[14]。