长足大竹象消化道不同分段菌群异质性及竹木质纤维素降解能力

唐 昊, 王明珺, 杨晓雯, 伍 敏, 罗 文, 罗朝兵

(乐山师范学院生命科学学院, 四川乐山 614000)

植食性昆虫消化道除具备完整的纤维素酶系统外，还栖息着大量细菌、原生动物、真菌和放线菌等(Oppertetal., 2010)。如Cazemier等(2003)在金龟子Pachnodamarginata幼虫肠道中发现大量木质纤维素降解细菌，Kim等(2017)从松褐天牛Monochamusalternatus肠道中鉴定出变形菌门(Proteobacteria)与厚壁菌门(Firmicutes)细菌，并发现其幼虫在取食不同食物时肠道微生物的优势菌属出现了显著差异，另在齿小蠹Ipspini、南部松小蠹Dendroctonusfrontalis等昆虫消化道也发现了大量具有水解纤维素活性的细菌(Delaliberaetal., 2005; Rogers and Doran-Peterson, 2010)。这些研究表明昆虫肠道共生微生物可能在降解昆虫取食的不同植物木质纤维素方面具有重要作用。

昆虫消化道可以细分为口器、前肠、中肠和后肠等不同分段，每个分段包含的细菌群落不同并具有高度的差异性，说明肠道共生微生物群落在肠道不同分段中具有一定的异质性(Handiqueetal., 2017; Pereira and Berry, 2017)。如员超(2014)在黄翅大白蚁Macrotermesbarneyi肠道微生物研究中发现变形杆菌门占中肠微生物总量的96% 以上，而在后肠中则以拟杆菌门(Bacteroidetes)(56.7%)微生物为主，但后肠中微生物群的种类更多且含有一些独特的微生物。另有研究表明在东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis肠道中，肠球菌、克雷伯氏菌、乳酸片球菌和威瑟氏菌是优势微生物，此外，东亚飞蝗肠道的中肠和后肠与前肠相比，具有更多样化和更稳定的微生物群落(龙文敏, 2009)。

目前，16S rRNA测序技术已广泛应用于许多植食性昆虫(白蚁、红棕象甲Rhynchophorusferrugineus、华山松大小蠹Dendroctonusarmandi等)肠道微生物的检测和鉴定(Hongohetal., 2006; Warneckeetal., 2007; Huetal., 2013; Muhammadetal., 2017)。对于长足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti而言，它是取食并危害慈竹、青皮竹和大叶慈竹等丛生竹竹种的主要害虫(Luoetal., 2018b)，它的肠道微生物参与了宿主对木质纤维素的降解(Luoetal., 2019)，并从其肠道中分离和鉴定出具有纤维素降解能力的菌种(如贝莱斯芽胞杆菌BacillusvelezensisLC1)(Lietal., 2020)。此外，长足大竹象发育转录组数据表明幼虫和成虫阶段有大量碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzyme, CAZy)基因的表达(Luoetal., 2018a)。但关于长足大竹象消化道各分段的细菌组成和菌落多样性的差异尚不明确。本研究利用16S rRNA测序技术，对长足大竹象幼虫不同消化道分段(口器、前肠、中肠和后肠)的共生细菌组成和多样性进行分析，并对相关菌群在木质纤维素降解方面的功能进行了预测和验证，结果可以为植食性昆虫的肠道共生微生物在木质纤维素高效降解和竹生物质的转化利用提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及取样

长足大竹象幼虫于2019年8月在四川省沐川县(28°96′N, 103°98′E)采集。采样方法：用刀将已有长足大竹象幼虫钻食的竹笋切开，从中取出幼虫，同时采集新鲜的高度为30 cm的竹笋，一同迅速带回实验室。将25头健康且生长趋势一致的5龄幼虫平均分成5组，分别放入5个饲养盒中后，同时投入等量新鲜去壳竹笋，将饲养盒放置于温度25±1℃和相对湿度70%±10%的黑暗环境下12 h。

无菌操作台上分别用75%酒精及无菌水反复擦拭处理幼虫体表5次后，使用无菌解剖工具取出消化道，并将口器(YB)、前肠(YFG)、中肠(YMG)和后肠(YHG)各段切断分离，分别放置于2 mL冻存管，液氮速冻后-80℃备用。 其中每个样本包含5头幼虫消化道分段，所有实验操作生物学重复5次。

1.2 DNA提取及16S rRNA测序

按照试剂盒说明，使用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit(D4015，Omega，美国)从长足大竹象5龄幼虫不同消化道分段口器、前肠、中肠和后肠中提取DNA，-20℃下储存并用于测序。

采用正向引物338F(5′-ACTCCGGGAGCAG CAG-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行扩增。PCR反应体 系(25 μL): 模板DNA 50 ng, Phusion Hot Start Flex 2×Master Mix(NEB, M0536L)12.5 μL, 正反向引物(20 μmol/L)各2.5 μL, ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序: 98℃预变性30 s; 98℃变性10 s, 54℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30个循环; 72℃终延伸2 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后用Ampre XTbeads(Beckman Coulter Genomics，美国)纯化，然后用Qubit(Invitrogen，美国)定量。构建扩增子池进行测序，并分别用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent，美国)和Library Quantification Kit(Kapa Biosciences，美国)评估扩增子文库的质量。PhiX Control Library(v3)与扩增子文库(预计为30%)相结合后，利用Illumina MiSeq仪器(Illumina Inc., San Diego, 美国)和标准Illumina测序引物进行测序。

1.3 长足大竹象幼虫消化道细菌多样性与组成分析

使用QIIME v1.9.1(http:∥qiime.org/)(DeSantisetal., 2006; Caporasoetal., 2010; Edgar, 2010; Edgaretal., 2011)对测序数据进行序列分析，构建可操作的分类单元(OTU)丰度表，最终获得一个改进的OTU丰度表(Bokulichetal., 2013)。利用PyNAST(v1.2.2)(Caporasoetal., 2009)进行多序列比对，利用FastTree(v2.1.9)(Priceetal., 2009)构建系统发育树。基于系统发育树和改进的OTU丰度表，用QIIME脚本计算α多样性(ACE index, Chao1 index, Shannon-Wiener index, Simpson index, 检测到的OTUs和PD whole tree index等)，并用phyloseq软件包(v1.20.0)估算β多样性(Bray Curtis，加权和未加权UniFrac)(McMurdie and Holmes, 2013)。α及β多样性数据均用R程序(v3.4.1)进行可视化处理。

1.4 组间丰度差异分析

用DESeq2(v1.16.1)分析组间丰度差异的OTU(Padj<0.01为统计学意义)(Loveetal., 2014)。使用Metastats分析(依赖于非参数t检验)分析不同分类等级的微生物丰度差异(Whiteetal., 2009)。样品中微生物的相对丰度按样品总读数归一化读数计数计算，相对丰度在所有样品中小于1%的微生物被归类为“其他”(P<0.05为统计学意义)。使用EDDA R包(v1.10.0)(Luoetal., 2014)进行Metastats分析。

采用LDA效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)算法鉴定在不同消化道分段中具有差异丰度的生物标志物(Segataetal., 2011)。本研究所有生物标志物均采用大于3(log10尺度)的效应大小阈值。

1.5 功能分析

PICRUSt软件(v1.1.2)可以预测不同宏基因组的功能，并按样本类型分组(http:∥picrust.github.io)(Langilleetal., 2013)。本研究利用PICRUSt基于16S rRNA数据预测其功能。首先，通过使用QIIMEv1.9.1并根据参考集合查询数据(GreenGenes数据库，13.8)(http:∥greengenes.lbl.gov)，其中OTU的识别率为97 %。由此得到的OTU用于PICRUSt微生物群落宏基因组预测，同时PICRUSt被用于推导相对京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径丰度。将不同消化道分段中细菌相对丰度≥5%的属定义为核心属(Turnbaughetal., 2009)。为了探究长足大竹象幼虫消化道不同分段共生细菌木质纤维素降解潜力，本研究在属水平分析了不同消化道分段核心菌群的碳水化合物活性酶(CAZy)。利用dbCAN网页包含的隐马尔可夫算法对核心属菌群进行了CAZy的注释(Yinetal., 2012)，随后与木质纤维素生物转化的模式菌哈氏噬纤维菌CytophagahutchinsoniiATCC 33406(Xieetal., 2007)比较了CAZy的种类和数量。

1.6 体外降解竹笋粉

为探讨长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群对竹笋木质纤维素的降解效率，使用已早期木质化的竹笋在65℃下干燥至恒重，使用粉碎机粉碎成颗粒，并通过40目筛网过滤。按照1.1节方法制备幼虫消化道分段样本，无菌冰浴条件下研磨样本，加入1 mL无菌水制成口器混合菌(MPJ)、前肠混合菌(FJ)、中肠混合菌(MJ)和后肠混合菌(HJ)悬液后，将混合菌悬液直接分别接种于液体培养基1(0.04 g酵母提取物, 0.1 g麦芽提取物, 2 g CaCO3和10 g竹笋粉, pH 7.2)中培养15 d。将2 mL培养物接种至到体培养基2(0.5 g酵母提取物, 0.5 g麦芽提取物, 0.5 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 0.13 gMgSO4·7H2O和0.5 g CaCl2, pH 7.2)中，37℃和150 r/min条件下恒温培养6 d。反应产物于100℃下处理30 min后，13 000 r/min离心10 min，然后收集沉淀物并在65℃下干燥至恒重。称重干燥沉积物，测定纤维素、半纤维素和木质素的含量，并用于扫描电镜。

采用Van-Soest法(Van Soestetal., 1991)定量木质纤维素含量，其中：

半纤维素含量=中性洗涤纤维-酸性洗涤纤维；

纤维素含量=酸性洗涤纤维-酸性洗涤剂木质素；

木质素含量=酸性洗涤剂木质素-灰分；

半纤维素降解效率=

纤维素降解效率=

木质素降解效率=

沉淀物经过冷冻干燥处理6 d后，研磨至粉状，取适量粉末样品用导电胶布贴于圆形贴片上，在成像之前，使用E-1010溅射镀膜机(日本)将金喷涂到约10 nm的厚度。用扫描电镜(Hitachi 3400N, Japan)进行分析，观察样品的表面形貌，扫描电镜的工作电流和电压分别为81 mA和10 kV。

1.7 数据分析

统计分析使用SPSS19.0(IBM SPSS, Armonk, NY，美国)进行。描述性数据用平均值±标准误表示。t检验用于比较两组的平均值；采用方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏新多重极差检验进行两组以上的组间比较。P<0.05表明存在显著差异。

2 结果

2.1 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群多样性

测序结果显示(图1)，从5个口器(YB)、5个前肠(YFG)、5个中肠(YMG)和5个后肠(YHG)样本共获得1 195 526个raw reads，其中在YB, YFG, YMG和YHG样本中分别有299 142, 339 069, 311 074和246 241 raw reads。α多样性结果表明，YFG菌群包含的物种多样性最高，YB最低。另外 YB组α多样性指数中Shannon-Wiener指数、Simpson指数、检测到的OTU数目和PD whole tree指数与其他组之间存在显著差异(P<0.05)，而YFG, YMG和YHG间无显著差异(P>0.05)，在消化道各段菌群多样性和丰富度呈现基本相似，YFG, YMG和YHG多样性大于YB多样性。

另对不同分段的菌群进行了β多样性分析，结果显示YB, YFG, YMG和YHG中不同细菌门的相对丰度相似，相对丰度最高的为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)(图2: A)。此外，以6种相对丰度最高的OTUs，分别为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas,Allobaculum, 阿克曼菌属Akkermansia,Odoribacter, 普氏菌属Prevotella和乳杆菌属Lactobacillus进行限制性主成分分析(图2: B)，结果表明YFG, YHG和YMG菌群分布相对集中，菌群中微生物的组成差异较小，但YB与YFG, YHG和YMG在菌群组成上差异较大。

图2 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群门水平非加权算术平均组群方法进化树(A)和属水平主成分分析(B)Fig. 2 Unweighted pair group method with arithmetic averages phylogenetic tree at the phylum level (A) and principal componentanalysis at the genus level (B) of microbiota in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti基于丰度最高的鞘氨醇单胞菌属, Allobaculum, 阿克曼菌属, Odoribacter, 普氏菌属和乳杆菌属进行限制性主成分分析。Principal component analysis was based on Sphingomonas, Allobaculum, Akkermansia, Odoribacter, Prevotella and Lactobacillus with the highest abundance.

2.2 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群组成及功能预测

对长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群进行了可操作分类单元(OTUs)门和属组成的鉴定，一共鉴定出19个门，其中12个门是所有样本共有，包括酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门等(图3: A, B)。YFG, YMG和YHG中，厚壁菌门(占36.1%～43.5%)、拟杆菌门(占29.7%～33.6%)和变形菌门(占10.9%～16.2%)的丰度最高，而YB中的变形菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度最高。此外鉴定到92属，其中34个属是所有样本共有，其中YB, YFG, YMG和YHG中分别鉴定出12, 6, 2和8个特有的属(图3: C, D)。在YB样本中，鞘氨醇单胞菌属(占17.6%)、粪杆菌属Faecalibacterium(占14.0%)、甲基杆菌属Methylobacterium(占9.3%)、分枝杆菌属Mycobacterium(占7.6%)和詹森菌属Janthinobacterium(占6.3%)相对丰度最高。YFG样本中阿克曼菌Akkermansia(占11.8%)、Odoribacter(占7.2%)、颤螺菌属Oscillospira(占6.4%)、拟杆菌属Bacteroides(占5.9%)、Allobaculum(占5.6%)、鞘氨醇单胞菌属(占5.6%)和Adlercreutzia(占5.5%)7个属相对丰度最高。YMG中相对丰度最高的5个属是Allobaculum(占12.8%)、阿克曼菌属(占8.3%)、颤螺菌属(占7.3%)、普氏菌属(占5.9%)和Adlercreutzia(占5.2%)，而YHG样本中所有属相对丰都均小于10%，其中普氏菌属(占9.8%)、乳杆菌属(占9.3%)、Odoribacter(占7.6%)、Allobaculum(占7.4%)、拟杆菌属(占5.8%)和阿克曼菌属(占5.5%)6个属相对丰度最高。

对长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群在KEGG L2水平进行了功能预测，结果表明不同分段菌群的功能可分为2类：一类包括核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、能量代谢(energy metabolism)和人类疾病、癌症(human diseases; cancer)等途径，主要富集于YFG, YHG和YMG；另一类包括外源物生物降解和代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)、其他氨基酸代谢(metabolism of other amino acids)和环境信息处理(environmental information processing)，主要富集于YB中(图4)。

2.3 长足大竹象幼虫消化道不同分段核心属菌群的碳水化合物活性酶(CAZy)分析

木质纤维素，如纤维素、半纤维素和木质素的降解需要多种碳水化合物活性酶(CAZy)。结果表明长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群一共有13个属被鉴定为核心属，其中YB, YFG, YMG和YHG分别鉴定出5, 7, 6和5个属，此外普氏菌属、Odoribacter、Allobaculum、拟杆菌属、阿克曼菌属、颤螺菌属、Adlercreutzia和鞘氨醇单胞菌属至少在两个消化道分段中相对丰度≥5%(表1)。除去分枝杆菌属和Allobaculum无基因组外，剩余11属包括鞘氨醇单胞菌属(23株系)、粪杆菌属(6株系)、甲基杆菌属(15株系)、詹森菌属(9株系)、阿克曼菌属(25株系)、Odoribacter(2株系)、颤螺菌属(1株系)、拟杆菌属(34株系)、Adlercreutzia(1株系)、普氏菌属(26株系)和乳杆菌属(30株系)的细菌基因组与木质纤维素生物转化的模式菌哈氏噬纤维菌CytophagahutchinsoniiATCC 33406比较碳水化合物活性酶的种类和数量(表2)，结果表明拟杆菌属细菌基因组中碳水化合物活性酶的数量最多，包括糖基水解酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶和碳水化合物结合模块。甲基杆菌属细菌基因组中糖基转移酶中的数量高于其他菌属细菌基因组，包括哈氏噬纤维菌ATCC 33406。此外，辅助活性(AA)在木质素解聚过程中起着重要作用，但只有部分詹森菌属、甲基杆菌属和乳杆菌属细菌基因组中存在少数辅助活性酶。这些结果表明这些核心属菌群基因组中存在丰富的碳水化合物活性酶，可能在木质纤维素降解中发挥重要作用。

表2 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群核心属细菌基因组中CAZy基因数量Table 2 Total numbers of putative CAZy genes in the genomes of bacteria belonging to core genera in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti

图4 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群KEGG功能分类Fig. 4 KEGG function classification of microbiota in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti

2.4 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群对竹笋粉的体外降解

我们利用不同分段的混合菌进行了竹笋粉体外降解实验，扫描电镜的观察结果表明，竹笋粉原始样品中木质纤维素表面粗糙，表面有沟壑，结构致密(图5: A)。长足大竹象幼虫消化道不同分段混合菌MPJ, FJ, MJ和HJ悬液处理6 d后，竹笋粉细胞壁变薄，纤维素空腔扩大，表面出现大量裂纹，竹笋粉表面存在一些皱褶和孔洞(图5: B-E)。通过对竹笋粉降解前后微观结构的比较，发现竹笋粉的组织结构被严重破坏，表明部分组织被混合菌降解。MPJ, FJ, MJ和HJ菌悬液在体外实验中对竹笋粉纤维素的降解率分别为21.7%, 39.9%, 44.2%和21.0%；对半纤维素降解率分别为72.7%, 52.3%, 65.7%和61.5%，对木质素降解率分别为20.5%, 41.3%, 39.9%和37.9%(图5: F-H)。这些结果表明共生菌群可降解纤维素、木质素和半纤维素，其中半纤维素的降解效率最高，中肠混合菌(MJ)纤维素降解效率最高。

图5 长足大竹象幼虫消化道不同分段菌群对竹笋粉体外降解Fig. 5 In vitro degradation of bamboo shoot particles (BSPs) by microbiota in different sectionsof the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buquetiA: 对照组竹笋粉微结构Microstructure of BSPs in the control group; B: MPJ处理后竹笋粉的微结构Microstructure of treated BSPs by MPJ; C: FJ处理后竹笋粉的微结构Microstructure of treated BSPs by FJ; D: MJ处理后竹笋粉的微结构Microstructure of treated BSPs by MJ; E: HJ处理后竹笋粉的微结构Microstructure of treated BSPs by HJ; F: 竹笋粉中纤维素降解效率Degradation efficiency of cellulose in BSPs; G: 竹笋粉中半纤维素降解效率Degradation efficiency of hemicellulose in BSPs; H: 竹笋粉中木质素降解效率Degradation efficiency of lignin in BSPs. MPJ: 口器混合菌Mouthpart mixed bacteria; FJ: 前肠混合菌Foregut mixed bacteria; MJ: 中肠混合菌Midgut mixed bacteria; HJ: 后肠混合菌Hindgut mixed bacteria.

3 讨论

本研究发现长足大竹象幼虫消化道YB分段的菌群与YFG， YMG和YHG分段的菌群在多个多样性指数上存在显著差异(图1)，另外YFG分段的菌群多样性最高，而YB最低，这与以白蚁为代表的昆虫肠道不同分段菌群间存在异质性的研究结论(Warneckeetal., 2007; Yangetal., 2005)类似。

值得注意的是，在YFG， YMG和YHG分段分段中，普氏菌属、Odoribacter、Allobaculum、拟杆菌属、阿克曼菌属、颤螺菌属、Adlercreutzia至少在两个消化道分段中相对丰度≥5%，但细分到具体的分段肠道中，优势菌属又存在一定的差异，也预示着不同消化道分段种细菌发挥的功能也存在差异，如Allobaculum在不同分段中相对丰度表现为后肠>中肠>前肠>口器(表1)，且其他研究显示Allobaculum可产生少量短链脂肪酸并将其在肠道中进行选择性的富集(Zhangetal., 2012)。此外，在4个肠道分段中，拟杆菌门的细菌均被检测到(图2)且菌群中拟杆菌属相对丰度在前肠和中肠中>5%(表1； 图3)，基因组中注释到的碳水化合物活性酶编码基因的数量最多(表2)，因而推测该属的细菌在降解纤维素上将发挥较大的作用，这与Robert等(2007)报道的拟杆菌属的Bacteroidescellulosilyticussp. nov.具有降解膳食纤维中多聚糖能力的结论相类似。相对而言，长足大竹象幼虫在消化道口器中甲基杆菌和鞘氨醇单胞菌等核心属丰度比前肠、中肠和后肠中更高(表1)，其中甲基杆菌能分泌1,4-葡萄糖苷酶(Ferreira Filhoetal., 2012)，鞘氨醇单胞菌能降解芳香族化合物(Schuleretal., 2008)等，这说明口器中含有的菌群在纤维素和木质素的降解上具有极大的潜力。

Hong等(2010)的研究表明昆虫消化道菌群异质性不仅可以反映肠道微生物群落结构的差异，也可以影响其功能的发挥，而本研究的结果也印证了这一观点，在长足大竹象幼虫消化道不同分段中，细菌群落的异质性与不同分段优势菌属细菌含有的碳水化合物活性酶编码基因数量的不同，将影响菌群在竹木质纤维素降解中发挥的作用(图5)。因此，本研究进一步验证了植食性昆虫的肠道共生微生物在木质纤维素降解利用上潜在价值，也可以为竹生物质的转化利用提供部分参考信息。