昆虫嗅觉结合蛋白研究进展

吴 帆, 张 莉, 邱一蕾, 李红亮

(中国计量大学生命科学学院, 浙江省生物计量及检疫检验重点实验室, 杭州 310018)

在自然界中，昆虫是地球上种类最多、分布最广的动物类群，与人类关系非常密切。据报道，已命名昆虫超过100万种，占节肢动物门80%以上，超过其他动物物种的总和(Zhang, 2013)。昆虫之所以能够在复杂的自然环境中脱颖而出，这与其精密复杂的嗅觉系统密不可分(Leal, 2013)。昆虫嗅觉系统包括中枢嗅觉系统和外周嗅觉系统两部分(Ong and Stopfer, 2012)，识别过程有4步：第1步，环境中气味或信息素分子通过扩散进入昆虫(触角、足等)体表特化的感受器中；第2步，在感受器嗅觉结合蛋白的协助下，穿过血淋巴传递至外周神经树突细胞膜上的嗅觉受体(Bentonetal., 2007)；第3步，信号分子与嗅觉受体发生作用，化学信号转化为电信号并激发树突神经兴奋；第4步，树突神经电信号经树突嗅神经叶处理传递到中枢神经，做出相应的行为和生理反应(Zhou, 2010; Leal, 2013)。

作为嗅觉系统的第一个参与者，嗅觉结合蛋白发挥着重要的作用(Pelosietal., 2014a)。嗅觉结合蛋白主要包括3类：气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 proteins, NPC2) (Leal, 2013; Pelosietal., 2014a; Zhuetal., 2018)。第一个嗅觉结合蛋白于1981年在多音天蚕蛾Antheraeapolyphemus触角中鉴定，之后研究者在多种昆虫中都有发现(Vogt and Riddiford, 1981)。本文之前，一些研究者曾对嗅觉结合蛋白作过综述(娄永根和程家安, 2001; 王桂荣等, 2002; 万新龙和杜永均, 2015)。但随着各种组学及生物信息学等技术的广泛应用，嗅觉结合蛋白的研究发展尤为迅速，又积累了丰富的知识。截至到目前，在双翅目、鳞翅目、膜翅目、鞘翅目和半翅目等昆虫中发现和鉴定到的嗅觉结合蛋白已经超过600个[根据Zhou(2010), Leal(2013)和 Pelosi等(2018a)等数据修正]，很多蛋白的生化功能和应用也得到了深入研究(Zhou, 2010; Britoetal., 2016; Pelosietal., 2018a; 张玉等, 2019)。本文对近年来嗅觉结合蛋白的分子特性、结构、功能和应用等方面取得的最新研究进展进行了总结和综述。

1 嗅觉结合蛋白的分子特性、结构和作用机制

嗅觉结合蛋白是一类低分子量可溶性的亲水蛋白，大小在15 kD左右，一般呈酸性。蛋白N端含有十几个氨基酸的信号肽，用于分泌到胞外发挥功能。高级结构为球状，可以和不同的配基分子结合。

1.1 气味结合蛋白

OBPs家族是最早发现的嗅觉结合蛋白，数量多而且最为复杂。它们最为显著的特征是丰富的α-螺旋和保守的半胱氨酸(Cys)(图1: A)(Zhou, 2010)。根据功能可把OBPs分为：普通气味结合蛋白(general odorant-binding proteins, GOBPs)、性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)和触角特异性蛋白(antennae specific proteins, ASPs)，早期研究认为GOBPs主要识别和结合普通气味分子，PBPs和ASPs主要识别和结合昆虫性信息素，其中ASPs是特异分布于触角的嗅觉结合蛋白(Zhouetal., 2009)。但是，随着研究的深入，研究者发现GOBPs, PBPs和ASPs识别的分子都具有广谱性，它们既可以识别普通气味分子也可以识别昆虫信息素，而且一个配基可以被多种蛋白结合，只是偏向于与特定的分子结合来发挥功能(吴帆等, 2016; Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。所以，OBPs的这种分类方式可能存在一定局限性。

图1 昆虫嗅觉结合蛋白三维结构模型示例Fig. 1 Examples of the 3D structure of olfactory binding proteins in insectsA: 意大利蜜蜂嗅觉结合蛋白AmelASP1三维结构3D structure of Apis mellifera ligustica olfactory binding protein AmelASP1 (Pesenti et al., 2008); B: 家蚕化学感受蛋白BmorCSP1三维结构3D structure of Bombxy mori chemosensory protein BmorCSP1 (Jansen et al., 2007); C: 日本弓背蚁尼曼-匹克C2型蛋白CjapNPC2三维结构3D structure of Camponotus japonicus Niemann-Pick type C2 protein CjapNPC2 (Ishida et al., 2014).

根据保守的半胱氨酸数量则可把OBPs家族分为：经典OBPs(classical OBPs)、多半胱氨酸OBPs(plus-C OBPs)、少半胱氨酸OBP(minus-C OBPs)和非典型OBPs(atypical OBPs)(表1)(Fanetal., 2011)。保守Cys形成的二硫键是影响和维持蛋白结构的主要原因之一。一般情况，6个及以上Cys形成3个二硫键，而4～5个Cys只形成2个二硫键。

表1 根据半胱氨酸(Cys)残基数对昆虫OBPs家族分类[改自Fan等(2011)]Table 1 Classification of OBPs family according to the number of cysteine (Cys) residues (adapted from Fan et al., 2011)

目前，利用X-射线晶体衍射和核磁共振等技术在昆虫中已经分析获得了20多个OBPs的三维结构，相关信息可以在蛋白质数据库PDB(https:∥www.rcsb.org/)中查询，它们均是以α-螺旋为基础的球形结构(Britoetal., 2016; 杜亚丽等, 2020)。

1.2 化学感受蛋白

CSPs是昆虫中发现的第2类嗅觉结合蛋白(图1: B)。1994年，McKenna等在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中首次发现CSPs基因，可能与化学感受功能相关，其蛋白被命名为OS-D (McKennaetal., 1994)。直到1999年，Angeli等在沙漠蝗Schistocercagregaria中发现类似的序列，确定其与信息素识别相关，命名为CSPs(Angelietal., 1999)。CSPs分子量较OBPs稍小，但同样具有α-螺旋和保守的Cys。CSPs一般只存在4个保守的Cys位点，形成2个二硫键来维持三级结构稳定(Sanchez-Graciaetal., 2009)。相对于OBPs，CSPs在进化上高度保守，不同物种间相似性也很高，比例高达40%～50%，高度保守性可能是CSPs数量比OBPs少的原因之一(Wanneretal., 2004)。CSPs编码基因在物种基因组中常常成簇出现，这也支持它们可能由相同基因进化而来的观点。在不同物种中，CSPs数量相差较大，如意大利蜜蜂Apismelliferaligustica有6个，家蚕Bombyxmori有22个(Foretetal., 2007; Gongetal., 2007)。目前，在昆虫中仅有甘蓝夜蛾MamestrabrassicaeMbraCSP2(MbraCSPA6)、沙漠蝗SgreCSP4和家蚕BmorCSP1(图1: B)3个CSPs蛋白结构获得解析(Lartigueetal., 2002; Tomasellietal., 2006; Jansenetal., 2007)。

1.3 尼曼-匹克C2型蛋白

NPC2最早是在脊椎动物中鉴定的蛋白，主要功能是负责转运胆固醇和脂类物质，与一些胆固醇异常的疾病发生相关(Storch and Xu, 2009)。后来，研究者在节肢动物门中的多个物种中发现NPC2，其中以螯肢动物最具有代表性，且昆虫NPC2分析表明其功能与OBPs有较高的相似性(Pelosietal., 2014a)，进而被认为是第3类具有昆虫嗅觉结合功能的蛋白。进化分析显示NPC2在节肢动物中是比OBPs和CSPs更早出现的可溶性蛋白分子(Vizuetaetal., 2020)。与OBPs和CSPs不同的是，昆虫中NPC2二级结构主要为β折叠(图1: C)，在此基础上形成了比OBPs和CSPs更大的内部结合腔(Ishidaetal., 2014)。同时，NPC2序列中也存在保守的Cys，数量在4～6个不等，可以形成2～3个二硫键来维持其稳定的三级结构(Zhuetal., 2018)。目前，在昆虫中仅有日本弓背蚁Camponotusjaponicus的CjapNPC2蛋白三维结构得到解析(Ishidaetal., 2014)。我们知道，OBPs和CSPs在昆虫中的二级结构主要是α螺旋，在哺乳动物中主要是β折叠(Pelosietal., 2014a)。但是，NPC2在昆虫和哺乳动物中的二级结构都是以β折叠为主。

1.4 影响嗅觉结合蛋白结构的外界因素

除了蛋白序列外，嗅觉结合蛋白结构还会受到其他因素的影响。第一，pH影响蛋白结构。对意大利蜜蜂气味结合蛋白OBP1结构分析发现，在pH为4.0, 5.5和7.0时，其结构和对配基的结合力都存在差异，在低pH时OBP1对蜂王信息素9-ODA结合力更强(Pesentietal., 2008)。这一结果与家蚕性信息素结合蛋白BmorPBP和冈比亚按蚊Anophelesgambiae气味结合蛋白AgamOBP1相反，它们在高pH时的结构更利于配基结合(Leeetal., 2002; Wogulisetal., 2006)。当到达嗅觉受体后，通过pH调节还可以促使气味结合蛋白释放配基来激活受体，这种通过pH调节结合力的现象对它们发挥功能十分重要(Yuetal., 2018)。第二，配基结合影响蛋白结构。意大利蜜蜂OBP14在与1-NPN、丁香酚、柠檬腈和溴化钽等配基结合后，其自身结构会发生改变(Spinellietal., 2012)。由于气味结合蛋白经常以二聚体形式发挥作用，这就导致一个配基结合后可能会影响其他配基的结合(Weietal., 2020)。第三，氨基酸位点突变影响蛋白结构和功能。蛋白质氨基酸序列决定其高级结构，所以氨基酸突变会影响蛋白构象，改变其配基结合力，特别是重要的氨基酸(Lietal., 2020)。比如，保守的Cys和能形成氢键的氨基酸改变对蛋白结合功能有重要影响(Spinellietal., 2012; Songetal., 2018)。研究表明，嗅觉结合蛋白的突变体只出现在昆虫特定的一些组织中，这就可能与特异功能密切相关(Xuanetal., 2014)。在大草蛉ChrysopapallensCpalOBP4蛋白氨基酸定点突变实验中，研究者也发现其关键氨基酸突变影响其对法尼醇等配基的结合力(Li TTetal., 2019)。第四，温度变化影响嗅觉结合蛋白对配基结合力。体外结合实验结果表明OBPs和CSPs与配基结合力受温度变化影响(Wuetal., 2019a)。大部分昆虫是变温动物，体温随外界环境变化而改变，但体内嗅觉结合蛋白与配基结合是否受影响还未见相关报道。

1.5 嗅觉结合蛋白作用机制

对于嗅觉结合蛋白结合、转运和释放配基分子作用机制的研究比较欠缺，理论研究还不完善且存在一定的争议。目前，嗅觉结合蛋白的作用机制主要有两种假说：pH依赖的调控机制和配基分子诱导的构象变化机制，其中pH依赖的嗅觉结合蛋白作用机制是主流观点。上面我们提到，在不同pH下，嗅觉结合蛋白对配基的结合力不同，特别是低pH降低结合力，这就暗示pH能够影响配基的结合和释放(Pesentietal., 2008; Leal, 2013, Fuetal., 2018)。进一步研究推测，触角淋巴液内的pH可能不是均一的，而是pH值变化的环境，“嗅觉结合蛋白-配基”复合物在淋巴液中的运输也受变化的pH调节，但在昆虫触角内并未得到证实(Dambergeretal., 2013)。如果能够通过理化技术证明触角淋巴液内pH是变化的，将有利于我们认知嗅觉结合蛋白的作用机制。另一种观点认为配基分子诱导的蛋白构象变化是嗅觉蛋白发挥作用的方式。我们知道，嗅觉结合蛋白对配基的结合具有广谱性，主要是其内部有一个疏水结合腔。反过来，气味或信息素分子也可以调节嗅觉结合蛋白结构改变，这种构象变化一方面使蛋白更好地与配基结合，另一方面，变化的嗅觉结合蛋白可以帮助配基靶向激活受体(Laughlinetal., 2008)。这种依赖嗅觉结合蛋白结合和转运的机制不仅适合多种气味和信息素分子进入触角，而且可以有效地防止它们被淋巴液中的气味/信息素降解酶(odorant/pheromone degrading enzymes, ODEs/PDEs)所降解，对嗅觉系统十分重要。

但是，也有观点认为部分疏水性外源分子到达受体过程中并不需要嗅觉结合蛋白的协助。在果蝇触角中，敲除高丰度表达的OBPs基因后，其触角上的不同感受器对外源气味信号的反应依然很强(Xiaoetal., 2019)。结构研究发现，在嗅觉感受器上分布着很多微孔小管(pore tubules)，每个感受器上平均约有83 000个，一些外源分子可以直接通过微孔小管扩散到达嗅觉受体，整个过程不需要嗅觉结合蛋白参与(Kaisslingetal., 1987; Larteretal., 2016)。不同感受器的结构和物质组成不同，比如，黑腹果蝇锥形感器上就分布着很多微孔小管，但其毛形感器上却没有微孔小管，而是高表达OBP76a蛋白，说明同一物种的不同感受器之间嗅觉作用机制也存在差异(Shanbhagetal., 2000)。

2 嗅觉结合蛋白的表达与分布

早期对嗅觉结合蛋白的研究主要都集中在昆虫的嗅觉感受器上，发现其在感受器淋巴液中高浓度表达(Klein, 1987)。在膜翅目、鳞翅目和双翅目等昆虫中最先发现的都是PBP，发现它们在雌雄虫中差异或特异表达，能够识别信息素类物质，如膜翅目意大利蜜蜂ASP1(Briandetal., 2001)，鳞翅目黄地老虎AgrotissegetumPBP(LaForestetal., 1999)。在研究昆虫寄生和取食等行为时在触角中又发现了大量的GOBPs，与识别植物源气味有关(Vogtetal., 1991)。后来，研究者发现OBPs在昆虫触角以外的组织中也有表达(李正西和Zhou, 2004; 李广伟等, 2017)。随着高通量测序和蛋白质组学的快速发展，加快了对嗅觉结合蛋白的研究(孟翔等, 2016)。在意大利蜜蜂中，总共存在21个OBPs，有13个在触角中有表达，其中在触角中特异表达的只有2个，其他的OBPs在脑、胸、卵巢和不同日龄幼虫中均有表达(Foret and Maleszka, 2006)。我们知道，影响嗅觉结合蛋白功能的两个因素是：表达丰度和结合能力，有些OBPs只在非嗅觉器官中表达，可能与特定功能有关，这将在蛋白功能部分详细介绍。

相较于OBPs，CSPs的分布则更加广泛，如在昆虫头部、跗节、下唇须、卵巢、腺体和表皮等都有表达。一方面是由于化学感受的感受器分布广泛，在昆虫体表毛发、跗节、口器和翅中均有化学感受器存在(张玉等, 2019)；另一方面是因为CSPs自身功能的多样性。意大利蜜蜂基因组分析确定了6个CSPs，其中CSP5和CSP6在触角中不表达，除了CSP5特异在蜂王卵巢和卵中表达外，其他CSPs在蜜蜂不同组织和发育不同阶段广泛表达(Foretetal., 2007)。家蚕中有22个CSPs，这些基因从卵到不同日龄幼虫、以及成虫脑、表皮、脂肪体、中肠和精/卵巢中都有分布，不同基因在时空上差异表达(Gongetal., 2007)。

目前，NPC2在昆虫中的研究还比较少。昆虫中，仅在膜翅目(意大利蜜蜂、中华蜜蜂Apisceranacerana、日本弓背蚁、中红侧沟茧蜂Microplitismediator)(Ishidaetal., 2014; Leeetal., 2014; Iovinellaetal., 2018; Zhengetal., 2018)、双翅目(冈比亚按蚊、埃及伊蚊Aedesaegypti、黑腹果蝇、柑橘大果蝇Bactroceraminax)(Shietal., 2012; Caicedoetal., 2019; 陈剑等, 2020)、鳞翅目(棉铃虫Helicoverpaarmigera、柞蚕Antheraeapernyi)(Zhuetal., 2018; Chenetal., 2020)、半翅目(黑肩绿盲蝽Cyrtorhinuslividipennis)(Wangetal., 2018)等4目11个种中发现了NPC2家族基因，数量也很少。这些基因功能研究很少，在昆虫中的时空表达也还缺少研究。但是，综合这些昆虫物种的数据以及哺乳动物的数据，我们可以确定NPC2基因在昆虫嗅觉器官和非嗅觉器官中都有表达，功能也各不相同。

3 嗅觉结合蛋白的功能

经过40年的研究，昆虫中嗅觉结合蛋白家族成员不断扩大。由于其相对简单而稳定的结构，使其能适应各种环境和任务，所以这些蛋白的功能复杂多样，且这些功能对昆虫生理和行为尤为重要。

3.1 识别转运外源气味和信息素分子

作为嗅觉结合蛋白，最初研究它们的功能就是在嗅觉系统中结合转运气味和信息素分子。OBPs, CSPs和NPC2均为球状结构，亲水性氨基酸分布于蛋白表面，使它们具有强水溶性，疏水性氨基酸在内部形成空腔，用于结合配基(Lartigueetal., 2002; Zhou, 2010)。疏水性的气味分子或信息素分子无法穿过淋巴液，所以在嗅觉结合蛋白的协助下到达嗅觉受体(Leal, 2013)。在意大利蜜蜂中，ASP1可以转运蜂王信息素HOB到达嗅觉受体(odor receptors, ORs)OR11(Briandetal., 2001; Wanneretal., 2007)。但是，嗅觉结合蛋白并不是简单地被动转运，它们可以识别不同的气味或信息素分子。研究发现，OBPs, CSPs和NPC2对配基结合虽然都有广谱性，但与不同分子的结合力不同(Wuetal., 2019a)。比如，意大利蜜蜂中大多数OBPs和CSPs都能和幼虫信息素β-罗勒烯和别罗勒烯结合，其中CSP4与两者结合力最强，且CSP4高表达的个体对幼虫识别能力更强，有利于幼虫识别和蜂王浆高产(Wuetal., 2019b)。所以，嗅觉结合蛋白可以特异识别和转运气味和信息素分子。

3.2 协助激活受体

嗅觉结合蛋白可以协助气味分子激活昆虫嗅觉受体。研究表明，昆虫嗅觉受体是一种配体门控离子通道，配基与受体结合后激活信号通路(Satoetal., 2008; Leal, 2013)。大多数配基都是直接激活嗅觉受体，但部分受体激活则需要嗅觉结合蛋白的参与，即形成“嗅觉结合蛋白-气味复合物”发挥作用(Leal, 2013)。LUSH(DmelOBP76a)是黑腹果蝇中第一个功能明确的气味结合蛋白，对信息素识别十分重要。研究发现，LUSH缺失型个体对信息素Z11-18OAc没有反应，只有LUSH存在时才能引起神经刺激，说明LUSH能够协助Z11-18OAc激活受体(Xuetal., 2005)。后续研究发现，黑腹果蝇雄性信息素成分顺式-Vaccenyl acetate也是通过与LUSH形成复合物来激活受体的(Laughlinetal., 2008)。目前，LUSH是唯一报道可以协助激活受体的气味结合蛋白，在其他昆虫中还未见需要气味结合蛋白协助来激活受体的报道。

3.3 缓冲作用

嗅觉结合蛋白依靠结合能力缓冲局部环境中某些分子的快速变化。在昆虫中，一些嗅觉结合蛋白在嗅觉器官中高丰度表达，但并没有转运外源分子的作用(Pelosietal., 2018a)。黑腹果蝇触角锥形感受器中OBP28a是唯一高丰度表达的气味结合蛋白，敲除后并不影响其嗅觉反应，而是在触角起到缓冲作用，即“增益控制”作用(Larteretal., 2016)。进一步研究发现，OBP28a在触角中缓冲的主要对象是β-紫罗兰酮等多种植物源气味分子，以防止这些物质的反复刺激(Gonzalezetal., 2020)。增益控制对于昆虫的任何感受系统都是必不可少的，比如昆虫对温度变化的调节以及昆虫脑中信号通路的调节(Tichyetal., 2008; Serranoetal., 2013)。在嗅觉系统下游，嗅觉受体神经元也是通过增益控制来调节神经活动，以防止神经系统的持续兴奋并提高嗅觉编码的灵敏度(Gorur-Shandilyaetal., 2017; Kadakia and Emonet, 2019)。缓冲作用对昆虫生理具有重要意义。

3.4 转运和释放内源信息素

昆虫体内分布很多腺体，部分嗅觉相关蛋白在昆虫腺体中高表达或特异表达，可以协助腺体中的信息素释放。我们知道，昆虫信息素极其丰富，在种间和种内的化学通讯中起到重要作用(Slessoretal., 2005)。在蜜蜂中，蛋白质组结果显示有9个OBPs和2个CSPs在下颌腺有分布(Danietal., 2010; Iovinellaetal., 2011)。对家蚕研究发现，7个CSPs在雌虫性信息素腺体中表达(Danietal., 2011)。序列分析发现，信息素腺体中CSPs还存在大量突变体，能让它们结合更多的配基(Xuanetal., 2014)。对黑腹果蝇雄虫的精液研究发现，其中存在6种OBPs，可以结合雄性信息素成分顺式-vaccenyl acetate (Dyanov and Dzitoeva, 1995; Takemori and Yamamoto, 2009)。在棉铃虫雄虫精液中富含高丰度的OBP10，其在交配过程中会由雄虫转移到雌虫体内，最终会留在受精卵表面(Sunetal., 2012)。东亚飞蝗Locustamigratoria雄虫生殖器中含有很多CSPs蛋白，其中一个高丰度的LmigCSP91可以较好地结合α-萘基丙腈和β-萘基丙腈(Banetal., 2013; Zhouetal., 2013)。除了性腺和生殖腺外，膜翅目昆虫的毒液腺中也发现了OBPs和CSPs。比如，在寄生蜂Leptopilinaheterotoma和Pteromaluspuparum的毒腺中都发现OBPs和CSPs的存在，可能与毒液分泌有关(Heavneretal., 2013; Wangetal., 2015)。蛋白质组分析显示意大利蜜蜂毒腺中存在OBP21，但尚不清楚其功能(Lietal., 2013)。在甘蓝夜蛾、小地老虎Agrotisipsilon和埃及伊蚊等的腺体中也发现了OBPs和CSPs(Pelosietal., 2014a)。所以，嗅觉结合蛋白在信息素合成和分泌过程中发挥作用。

3.5 发育、修复和组织再生

OBPs和CSPs参与到昆虫个体发育，甚至是组织再生。最早研究嗅觉结合蛋白与发育相关的是美洲大蠊Periplanetaamericana，发现在其足的再生过程中，PameP10的表达量显著上调(Nomuraetal., 1992; Kitabayashietal., 1998)。在意大利蜜蜂中，转录组数据显示CSP5在卵巢和卵中特异表达，与胚胎的正常发育密切相关(Foretetal., 2007; Maleszkaetal., 2007)。在红火蚁Solenopsisinvicta中，其Si-CSP9在3日龄幼虫中高表达，通过影响脂肪酸的生物合成以及其他代谢通路调节角质层的发育和蜕皮(Chengetal., 2015)。在埃及伊蚊中，AaegOBP1, AaegOBP11, AaegOBP13, AaegOBP44和AaegOBP45可能与卵膜的形成有关，但具体的调控机制尚不清楚(Amenyaetal., 2010; Costa-da-Silvaetal., 2013)。在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中，SexiCSP3在雌虫生殖器中表达量高于雄虫，RNAi干扰后会抑制其产卵能力，而且卵的孵化率显著降低，说明其参与卵的形成和发育(Gongetal., 2012)。对沙漠飞蝗散居和群居个体的比较中，发现两者生理和行为方面有很大的差异，但却可以相互转化，这个转化过程与CSPs的表达变化密切相关(Guoetal., 2011)。

3.6 抗炎免疫活性

嗅觉结合蛋白的抗炎免疫作用是研究者在吸血类昆虫中发现的。蚊虫叮咬后，宿主自身的免疫反应会使血液凝集以防止吸血，研究发现斯氏按蚊Anophelesstephensi唾液中的一些OBPs起到血液抗凝剂的作用，防止进食中断(Isawaetal., 2002)。蚊虫取食过程中，宿主会分泌去甲肾上腺素和5-羟色胺等生物胺类物质，可引起肿胀、红斑和瘙痒等症状，在冈比亚按蚊和埃及伊蚊的唾液中含有一些OBPs，它们对这些生物胺有很强的亲和力，通过抑制宿主炎症反应可以使取食顺利进行(Mansetal., 2007; Calvoetal., 2009)。对黑腹果蝇研究发现，过表达的NPC2a和NPC2e可以通过双翅杀菌肽启动子来激活其先天免疫(Shietal., 2012)。此外，埃及伊蚊和白蛉Phlebotomusargentipes中一些D7相关蛋白和OBPs有相似结构，具有免疫原性(Martín-Martínetal., 2013; Oktariantietal., 2015)。对中华蜜蜂NPC2功能分析时，发现细菌和真菌感染初期AcNPC2a在激发先天免疫方面也发挥重要作用(Leeetal., 2014)。在埃及伊蚊中，NPC2对其降低登革热病毒感染方面效果显著(Caicedoetal., 2019)。这些作用的信号通路和调控过程还不清楚，相关功能和调节机制需要进一步研究。

3.7 耐药性作用

昆虫防治面临的主要问题之一就是耐药性，而耐药性的产生一个原因可能与嗅觉结合蛋白有关。用阿维菌素处理家蚕时，它们体内20个CSPs在不同组织中增强表达，部分蛋白对阿维菌素还有较好的亲和力(Xuanetal., 2015)。用亚致死剂量的新烟碱类杀虫剂防治烟粉虱Bemisiatabaci时，其BtabCSP1在腹部表达量升高(Liu GXetal., 2014)。对于小菜蛾Plutellaxylostella，用汴氯菊酯处理后其体内OBP13, CSP4和CSP8表达量增高(Bautistaetal., 2015)。这些蛋白一方面直接结合农药分子起到抗药性作用，另一方面可能激活下游信号通路调节耐药性产生。目前，研究者只是发现杀虫剂处理后嗅觉结合蛋白表达量增加，但是这些蛋白调控耐药性的机制尚不清楚(Pelosietal., 2018a)。

3.8 味觉和营养功能

昆虫嗅觉结合蛋白在味觉器官中高表达，可能参与摄食和营养吸收等功能(Sanchez-Graciaetal., 2009)。首先，昆虫嗅觉结合蛋白可以帮助昆虫摄取疏水性物质。对绿头蝇Phormiaregina研究发现，它们喜食富含脂肪酸的腐肉，但这些脂肪酸不溶于水，而其味觉中的PregOBP57a可能通过pH变化来摄取脂肪酸类物质(Ishidaetal., 2013)。在棉铃虫中，HarmCSP4在口器中高表达，能够结合疏水性成分β-胡罗卜素来摄取营养(Zhuetal., 2016)。其次，昆虫嗅觉结合蛋白可以协助取食过程。在一些飞蛾和蝴蝶中，发现它们口器中CSPs含量很高。比如，甘蓝夜蛾的口器中CSPs大量表达，它们在取食过程中调节宿主的生理状况，以便甘蓝夜蛾取食(Nagnan-Le Meillouretal., 2000)。在棉铃虫和烟青虫Helicoverpaassulta成虫喙中，CSP4大量表达，在其吸吮叶汁时分泌CSP4来降低静水压保证摄食过程顺利进行(Liu YLetal., 2014)。最后，嗅觉结合蛋白对一些重要的营养物质具有高亲和力。对于黑腹果蝇来说，L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺是必需氨基酸，其体内分布的OBP19b对这些物质具有高亲和力，有利于快速结合和转运这两种氨基酸(Rihanietal., 2019)。对一些吸血类昆虫的研究发现，它们嗜血行为可能与CSPs基因家族进化有关，影响了它们的取食习惯(Freitas and Nery, 2020)。

4 嗅觉结合蛋白的应用

4.1 生物防治与物种保护

众所周知，嗅觉系统在昆虫觅食、寻偶交配和寻找寄主等方面都发挥着重要作用(Leal, 2013)。昆虫种类繁多，但大部分都是农林害虫。因此，我们可以通过嗅觉系统的特性利用反向化学生态学的方法研究生物防治的策略。

基于昆虫嗅觉设计的生物防治有诱杀和毒杀两种方式。诱杀是利用昆虫信息素来进行引诱防治(Brandetal., 1979)。褐翅椿象Plautiastali是一种为害水果和蔬菜的农业害虫，研究者根据其聚集信息素成分合成的物质methyl (E,E,Z)-2,4,6-decatrienoate可以高效引诱雌雄虫，进而设计陷阱捕杀(Jangetal., 2011)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的主要性信息素成分为(4aS,7S,7aR)-nepetalactone和(1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol，它们对豌豆蚜有显著的引诱作用，可以通过合成其性信息素或类似物来进行诱杀(Nakashimaetal., 2016)。毒杀是通过一些物质抑制或阻断昆虫嗅觉系统信号传递，即可以根据昆虫嗅觉结合蛋白的结合特性设计与其结合力强的杀虫剂分子(Pelosietal., 2018a)。二点委夜蛾Athetislepigone体内有两个气味结合蛋白AlepOBP1和AlepOBP2，AlepOBP1对杀虫剂毒死蜱和肟硫磷有强结合力，AlepOBP2与性信息素(Z)-7-dodecenyl acetate和(Z)-9-tetradecenyl acetate结合，可以人工合成同时具有AlepOBP1和AlepOBP2蛋白结构的分子对其进行防治(Zhangetal., 2020)。(E)-β-法尼烯是豌豆蚜重要的报警信息素，可以用于防治豌豆蚜，但由于其易挥发和氧化，所以难以推广和应用。研究者根据(E)-β-法尼烯的结构合成其类似物，同时在其上加上杀虫剂的吡唑结构，使其具有高效的杀虫效果(Sunetal., 2011)。

值得注意的是，在生物防治的过程中，我们要形成保护益虫的意识。对中华蜜蜂嗅觉研究发现，新烟碱类杀虫剂吡虫啉能够影响ASP2对气味分子的识别能力，可能导致嗅觉反应迟钝(Lietal., 2015)，类似的情况在中华蜜蜂CSP1(Lietal., 2017a)和茶尺蠖EctropisobliquaGOBP2蛋白中也有发现(Lietal., 2017b)。所以，农药对嗅觉结合蛋白的影响具有两面性：即可毒杀害虫也可能损害益虫的嗅觉感受系统。研究者在设计农药时不仅要考虑防治害虫，还要考虑不要对益虫产生影响，以提高杀虫剂的特异性。

4.2 用于品种选育的分子标记

利用分子标记辅助育种在动植品种选育方面都有应用，嗅觉结合蛋白也是一种重要的标记物。对意大利蜜蜂研究发现，其工蜂通过触角中CSP4识别幼虫信息素β-罗勒烯和别罗勒烯来哺育幼虫，如果通过选育CSP4蛋白高表达的蜜蜂品系则有利于帮助培育出蜂王浆高产的蜜蜂(Wuetal., 2019b)。在选育的意大利蜜蜂中，发现清理行为强的蜜蜂触角中OBP17和OBP18高表达，它们可能通过这两个蛋白识别病原微生物来减少蜂群的致病率(Huetal., 2016)。这种通过嗅觉结合蛋白选育的蜜蜂在高产和抗病方面发挥重要作用。在此基础上，研究者通过利用分子建模、分子对接和系统发育等方法，建立了一种快速分析蜜蜂气味结合蛋白与气味分子的配对模式，如OBP16-N-phenyl-2-napthalamine、OBP1-可卡因、OBP10-美沙酮、OBP2-大麻之间有较好亲和力，这不仅给选育提供了新的方向而且加快了选育过程，可以通过选育和训练使蜜蜂能够识别毒品和炸药类物质，进而在实践中得以应用(Langeswaranetal., 2018)。目前，基于嗅觉结合蛋白选育新的品系只在益虫(蜜蜂、家蚕等)中有研究，在害虫中还未见报道。

4.3 制作生物传感器

自嗅觉结合蛋白发现后，研究者一直希望通过它们的特异性和灵敏性设计高效的生物传感器。通过细菌表达昆虫嗅觉结合蛋白，再利用理化方法偶联在感应装置上来检测特定物质，检测能力都在微摩尔范围内(Pelosietal., 2014b)。作为模式生物，对蜜蜂嗅觉蛋白的配基结合谱的研究较多，其中OBP2(ASP2)和OBP14已经被制作成生物传感器用来检测环境中气味分子的变化(Luetal., 2014; Larisikaetal., 2015)。在黑腹果蝇中，LUSH对醇类物质有很好的识别能力，利用其设计的生物传感器已经用来检测火腿和牛肉中沙门氏菌的含量(Sankaranetal., 2011; Sonetal., 2016)。利用冈比亚按蚊AgamOBP1重组表达蛋白设计的传感器，可以用来测试大肠菌群特征代谢物吲哚的存在，进而分析饮用水污染情况(Dimitratosetal., 2019)。此外，AgamOBP1的突变体与大麻、摇头丸和可卡因等毒品成分有很高亲和力(Khasim and Krishna, 2020)，这在功能上与蜜蜂的气味结合蛋白有相似之处(Langeswaranetal., 2018)，也是作为开发新型生物嗅觉检测器的潜在蛋白。这些结果都充分说明利用嗅觉结合蛋白设计生物传感器的可行性与巨大的应用价值。

但是，由于对嗅觉编码认知的局限性以及缺乏有效的嗅觉感应元件，所以嗅觉传感器一直没有得到广泛应用。第一，嗅觉编码十分复杂，我们对嗅觉蛋白的配基结合谱的研究还不足。对已经研究的嗅觉结合蛋白分析发现，一个蛋白可以识别和结合多种配基，而一个配基也可以被多种蛋白结合，这就导致检测准确性降低 (Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。如果要利用这些蛋白制作传感器，就需要找到它们特异且高亲和的配基分子。第二，需要开发有效的嗅觉感应元件。目前，在传感器中使用的感应方法包括电化学阻抗法等，虽然检测能力达到微摩尔水平，但与昆虫的识别能力还有很大的差距(Luetal., 2014; Pelosietal., 2018b)。最近，研究者利用硅纳米线(silicon nanowire, SiNW)制作的生物传感器的检测限已经达到十亿分之一，在检测能力上有了很大进步，可能具有广泛的应用前景(Gao, 2020)。此外，很多感应元件还存在携带不便、使用麻烦和制作困难等缺点，特别是实验室之外使用难度大，这就造成嗅觉结合蛋白在传感应用方面的局限性。因此，科研工作者在未来研究中需要探索更高效的生物传感装置。

5 结语

昆虫嗅觉系统极其灵敏，这与其嗅觉结合蛋白密切相关。在昆虫中鉴定的嗅觉结合蛋白已经超过600个，它们结构复杂且在昆虫体内分布范围广泛，功能多样，具有巨大的潜在应用价值。但是，相关的研究还远远不足，未来对嗅觉结合蛋白结构、功能以及发挥作用的机制应该是研究的重点。如果深入研究，那么基于昆虫嗅觉结合蛋白的生物防治、资源选育和生物嗅觉传感器等都具有广泛的应用前景。