植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母三种微生物对黑腹果蝇行为和发育的影响

王 露, 魏博帆, 李苗苗, 李晓哲, 王 博, 阚云超, 乔惠丽

(南阳师范学院, 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室, 河南南阳 473061)

后生动物的肠道通常有多种细菌和其他微生物，肠道微生物可通过宿主与微生物的互作、不同微生物之间的互作产生不同的代谢产物，进而影响宿主的营养代谢(Newell and Douglas, 2014; Wongetal., 2014; Leitão-Gonçalvesetal., 2017)、发育(Shinetal., 2011; Storellietal., 2011; Ridleyetal., 2012; Tefit and Leulier, 2017; Qiaoetal., 2019)、寿命(Guoetal., 2014; Clarketal., 2015; Leeetal., 2019)、免疫(Sansoneetal., 2015)和疾病(vanetal., 2013; Zhangetal., 2015)等许多生理和病理过程。肠道微生物与宿主间的互作已成为近年国内外研究的热点。

黑腹果蝇Drosophilamelanogaster作为一种重要的模式生物，被广泛用于宿主与肠道微生物的互作研究。在自然条件下，果蝇中的大部分种类以腐烂的水果或植物为食，广泛存在于人类的栖息地内，可能干扰人类的正常工作和生活，也可能成为食物的污染源，部分果蝇种类还能带来巨大的经济损失(Harrington and Axtell, 1994; Benton, 2010)。研究发现，果蝇可通过识别酵母和腐烂水果的挥发性气味分子来定位食源和产卵地点(Stökletal., 2010; Becheretal., 2012; Keeseyetal., 2015)。此外，果蝇的寄生环境中往往会存在有害的真菌和细菌，果蝇肠道微生物可产生抑制有害真菌和细菌生长的物质(Mauchetal., 2010; Crowleyetal., 2012)。通过对果蝇肠道微生物多样性的研究，发现黑腹果蝇肠道微生物的组成相对比较简单，其种类主要为醋酸杆菌属Acetobacter和乳酸杆菌属Lactobacillus，此外还包含一些酵母菌和其他微生物(Chandleretal., 2011; Wongetal., 2011; Broderick and Lemaitre, 2012; Staubachetal., 2013; Wongetal., 2017)。研究表明，果蝇幼虫和成虫生存环境中的微生物不仅可影响果蝇的肠道微生物组(Chandleretal., 2011)，还可影响果蝇的觅食、发育、交配和产卵等行为(Keeseyetal., 2017; Leitão-Gonçalvesetal., 2017; Tefit and Leulier, 2017; Wongetal., 2017)。果蝇的幼虫和成虫对经幼虫取食过食物的偏好大于对未经取食过或无菌果蝇取食过的无菌食物(Durisko and Dukas, 2013; Duriskoetal., 2014)，幼虫肠道细菌所产生的气味分子在此过程中发挥作用(Venuetal., 2014)。

在黑腹果蝇中，肠道微生物对发育的调控主要通过胰岛素信号通路，胰岛素样受体基因(insulin-like receptor gene,InR)的转录通过FoxO转录因子的活性直接负调控胰岛素信号通路，因此，InR的表达可作为果蝇胰岛素样肽(insulin-like peptides, dILPs)系统活性的负调控分子标记(Puig and Tjian, 2005)。InR作为该信号通路的负调控基因，其表达量越低，该信号通路活性越高，果蝇的发育越快(Storellietal., 2011)。目前关于肠道微生物影响黑腹果蝇行为和发育的研究已有较多报道，但肠道微生物种类较多，不同的微生物具有不同的生物学特性，从而使其对宿主的影响和调控机制各不相同。此外，肠道微生物之间、肠道微生物与寄生环境中微生物之间的互作是否影响果蝇的行为，目前还不清楚。

本研究选取2种代表性的果蝇肠道微生物植物乳杆菌Lactobacillusplantarum和苹果醋酸杆菌Acetobactermalorum及环境中影响果蝇觅食的关键微生物酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，采用引诱实验和产卵选择实验研究其对交配前后黑腹果蝇的觅食和产卵行为的影响，检测不同微生物的混合物对黑腹果蝇行为调控的变化，检测这3种微生物对黑腹果蝇幼虫发育及相关基因表达的影响，研究结果将为进一步研究肠道微生物与果蝇的互作和调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 果蝇品系和饲养

本研究选用黑腹果蝇品系Canton S，在培养箱温度25±2℃，相对湿度70%±5%，光周期12L∶12D的条件下饲养(常州海博SX-500)。黑腹果蝇饲养培养基的配方(1 000 mL): 22 g啤酒酵母粉，95 g玉米粉，118 g红糖，4.2 g琼脂粉(Solarbio)，2.4 mL丙酸(天津化工)，3.3 mL对羟基甲酸甲酯(30%)(天津化工)。收集黑腹果蝇卵的葡萄汁固体培养基的配方: 100 mL葡萄汁，1 mL乙酸(天津化工)，1 mL乙醇(天津化工)，1 g琼脂糖(Solarbio)。收集黑腹果蝇卵时在平板上添加少量的酵母膏(Qiaoetal., 2019)。

1.2 供试菌株体外培养及接种

实验供试菌株购自德国DSMZ微生物保藏中心的植物乳杆菌(20174-0916-001)、苹果醋酸杆菌(14337-0313-001)和酿酒酵母(1333-0317-001)。植物乳杆菌和苹果醋酸杆菌用MRS肉汤培养基，酿酒酵母用YPD培养基(Solarbio)于30℃ 200 r/min摇床恒温培养(上海智诚ZWY-240)，相应的固体培养基添加1.5%的琼脂(Solarbio)。3种不同微生物分别于30℃摇床培养24 h，新鲜菌液用紫外可见光分光光度计(Eppendorf)在600 nm处测OD值，然后分别取1 mL OD600=1的上述3种菌液，用PBS进行洗涤后重悬于100 μL的PBS，接种于不含对羟基甲酸甲酯的中号果蝇培养瓶的培养基中，使每个菌液样品铺满果蝇培养基表面。对照为不添加任何微生物的正常培养基。

1.3 黑腹果蝇成虫引诱实验

未交配的雌、雄果蝇成虫主要行为是觅食和交配，非处女蝇则为觅食和产卵。为了明确不同微生物在黑腹果蝇寻找食源和产卵地点中的作用，我们首先采用引诱实验检测交配前后雌、雄黑腹果蝇成虫对3种微生物的趋性。

1.3.1单一微生物对交配前后雌雄黑腹果蝇的引诱力检测：黑腹果蝇成虫引诱实验在一个高度为10 cm，上下直径分别为15.5 cm和14 cm的圆柱形塑料透明容器中进行，顶部盖子上有透气孔，内部倒置两个高4.5 cm，直径3 cm的塑料小瓶，瓶底插入一个顶端开口直径为2 mm的塑料枪头，瓶盖内部各放一个直径为5 mm的滤纸片，先加30 μL浓度为80%的甘油，再分别添加用对应培养基清洗浓缩至50 μL的菌液(取1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液用对应培养基清洗浓缩至50 μL)或等体积的正常培养基(对照)。每组实验中，25头4-5日龄的未交配或交配后的雌、雄黑腹果蝇，经饥饿处理24 h后被转移到上述引诱装置中，24 h后对每个塑料小瓶内外的果蝇数据进行统计。引诱指数(attraction index,AI)的计算公式为:AI=(O-C)/T，其中，O是添加菌液的塑料小瓶中的果蝇数量，C是添加正常培养基的塑料小瓶中的果蝇数量，T是测试果蝇的总数。引诱指数从-1(完全回避)到1(完全吸引)，引诱系数为零表示中性。所有实验条件与黑腹果蝇饲养条件相同，每组实验5个重复。

1.3.2两种不同微生物对黑腹果蝇非处女蝇的引诱力检测：在黑腹果蝇的自然取食环境中，微生物的种类多种多样，为检测在不同微生物存在的情况下对黑腹果蝇行为的影响，在1.3.1节结果的基础上，选取对3种微生物都具有明显趋向性的雌性非处女蝇，进一步检测其在两种不同微生物之间的趋向性。

同1.3.1节中的方法，用植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的两两组合对黑腹果蝇进行引诱实验。 取1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液清洗浓缩为50 μL，不同组合的菌液分别被添加到引诱装置中两个不同塑料小瓶内的滤纸片上，25头4-5日龄非处女蝇经饥饿处理24 h后被转移到1.3.1节中的引诱装置中，24 h后对每个塑料小瓶内外的果蝇数量进行统计，并计算引诱系数，每组实验5个重复。

1.3.3单一微生物和不同微生物混合物对黑腹果蝇非处女蝇的引诱力检测：同1.3.1节中的方法，用植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母分别与这3种微生物的2种或3种的混合物进行竞争性引诱实验。单一微生物为取1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液清洗浓缩为60 μL，2种不同微生物的混合物为取1.2节OD600=1的2种菌液各1 mL分别清洗浓缩为30 μL，2种菌的总体积仍为60 μL，3种不同微生物的混合物为取1.2节OD600=1的3种菌液各1 mL分别清洗浓缩为20 μL，3种菌的总体积仍为60 μL。同上，25头4-5日龄的非处女蝇经饥饿处理24 h后被转移到1.3.1节中的引诱装置中，24 h后对每个塑料小瓶内外的果蝇数据进行统计，并计算引诱系数，每组实验5个重复。

1.4 黑腹果蝇产卵选择实验

基于上述结果，为进一步探究3种微生物对黑腹果蝇产卵选择的影响，我们采用产卵选择实验，分别检测雌性非处女蝇对植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的单一微生物、两种不同微生物、单一微生物与不同微生物混合物之间的产卵选择偏好。

1.4.1黑腹果蝇对单一微生物的产卵偏好性检测：黑腹果蝇产卵实验采用一个高度为9 cm，上下直径分别为12 cm和10 cm的圆柱形塑料透明容器中进行，顶部盖子上有透气孔，内部放置一个直径为90 mm的琼脂糖固体平板，平板对应两侧各放一个直径为5 mm的滤纸片，先加30 μL浓度为80%的甘油，然后再分别添加50 μL的菌液(1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液)或等体积的正常培养基。30头4-5日龄雌性果蝇被转移到上述产卵装置中，24 h后统计平板中间线两侧卵的数目，并计算产卵指数(oviposition index,OI)。产卵指数OI的计算公式为:OI=(O-C)/(O+C)，其中，O为平板上添加微生物一侧卵的数量，C为添加正常培养基一侧的卵的数量。每组实验5个重复。

1.4.2黑腹果蝇在两种不同微生物间的产卵偏好性检测：同1.4.1节中的方法，用植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的两两组合检测黑腹果蝇的产卵趋性。分别在产卵装置中的琼脂糖平板的两侧的滤纸片上各添加50 μL处理后的不同菌液(1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液)，然后放入30头4-5日龄雌性果蝇，24 h后统计平板中间线两侧卵的数目，并计算产卵指数。每组实验采用5个重复。

1.4.3黑腹果蝇在单一微生物与不同微生物混合物间的产卵偏好性检测：同1.4.1节中的方法，检测果蝇对植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母这3种微生物中的两种或3种的混合物的产卵选择。单一微生物为取1.2节1 mL OD600=1的新鲜菌液清洗浓缩为60 μL，两种不同微生物的混合物为取1.2节OD600=1的两种菌液各1 mL分别清洗浓缩为30 μL，两种菌的总体积仍为60 μL，3种不同微生物的混合物为取1.2节OD600=1的3种菌液各1 mL分别清洗浓缩为20 μL，3种菌的总体积仍为60 μL。产卵装置中放入30头4-5日龄的雌性果蝇，24 h后统计平板中间线两侧卵的数目，并计算产卵指数。每组实验5个重复。

1.5 含不同微生物的培养基上黑腹果蝇幼虫发育观测

为了研究黑腹果蝇的产卵选择偏好是否与其幼虫的发育相关，我们进一步检测黑腹果蝇幼虫在接种有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的活菌或灭活菌的培养基中的发育和化蛹情况。首先收集黑腹果蝇产下4 h内的卵，一部分分别转移到1.2节制备的接种有100 μL植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的培养基和正常培养基(对照)中，每瓶放入50粒卵，正常条件下培养72 h后对不同培养基上培养的幼虫进行称重，并在体视显微镜下拍照(Nikon SMZ-1500)。每组称重幼虫为10组生物学重复。

另一部分果蝇卵放入分别接种有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母(活菌或灭活菌)培养基及正常培养基中，每瓶50粒卵。 3种微生物的活菌分别为取1.2节每1 mL OD600=1的菌液分别清洗浓缩为100 μL；3种微生物的灭活菌分别为取1.2节每3 mL OD600=1的菌液清洗浓缩为100 μL，并高压灭菌。果蝇卵移入之日记为0 d，每天8∶00和20∶00统计化蛹数，至全部化蛹。每组实验10个重复。

1.6 qRT-PCR检测黑腹果蝇幼虫体内InR的表达水平

为了进一步探索微生物影响黑腹果蝇幼虫发育的分子机制，利用qRT-PCR检测胰岛素信号通路基因InR在不同幼虫中的表达情况。同1.5节中的方法，将黑腹果蝇卵在分别接种有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的培养基和正常培养基中培养，72 h后收集各组幼虫100头，用无菌水清洗体表，液氮速冻并研磨后，利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，利用oligo dT引物反转录合成cDNA(Thermofisher)。以果蝇rp49基因作为内参基因(rp49-F: 5′-CGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3′; rp49-R: 5′-AAACGCGGTTCAGCATGAGC-3′)，用FastStart通用型SYBR® Green预混液(Roche)检测InR(InR-F: 5′-AACAGTGGCGGATTCGGTT-3′; InR-R: 5′-TACTCGGAGCATTGGAGGCAT-3′)的表达水平(Storellietal., 2011)。扩增条件: 95℃预变性5 min; 95℃变性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环；最后72℃延伸10 min，溶解曲线范围为65～95℃。

1.7 数据分析

各组实验数据取平均值±标准误，qRT-PCR采用2-△△Ct计算分析基因的相对表达量(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；△△Ct=△Ct样品-△Ct对照)，3组实验重复。用Prism5.0软件进行绘图，并用t检验、Tukey氏多重比较检验和双因素方差分析分别进行数据分析。

2 结果

2.1 不同微生物对交配前后雌雄黑腹果蝇的引诱力差异

结果表明，未交配雌、雄黑腹果蝇成虫都趋向于酿酒酵母和植物乳杆菌，尤其是酿酒酵母(P<0.001)，而对苹果醋酸杆菌没有明显的趋性(图1: A)。交配后的雌蝇对酿酒酵母和植物乳杆菌的趋性与雄蝇基本一致(P<0.001)，但雌蝇的趋性比雄蝇更明显，值得注意的是，交配后的雌、雄果蝇对苹果醋酸杆菌表现出不同的趋性，苹果醋酸杆菌可以显著引诱雌蝇(P<0.05)，而对雄蝇无明显影响(图1: B)。

图1 不同微生物对未交配(A)和交配后(B)黑腹果蝇成虫的引诱指数Fig. 1 Attraction index of different microbes to unmated (A) and mated (B) adults of Drosophila melanogasterSc: 酿酒酵母菌液Culture of Saccharomyces cerevisiae; Lp: 植物乳杆菌菌液Culture of Lactobacillus plantarum; Am: 苹果醋酸杆菌菌液Culture of Acetobacter malorum; CK: 正常培养基(对照)Normal medium (control). 引诱指数Attraction index (AI)=(O-C)/T. O: 趋向菌液的果蝇数量Number of flies attracted by microbe culture; C: 对照组果蝇数量Number of flies in the control; T: 测试果蝇的总数Total fly number in the test. 下图同The same for the following figures. 取1 mL OD600=1的微生物新鲜菌液清洗重悬为50 μL。图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示每组数据与零相比的差异显著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05)(t检验)。1 mL fresh microbe culture with the OD600 value of 1 are washed and resuspended in 50 μL. Data in the figure are mean±SE. The asterisks above bars indicate the significance of differences of the data compared to zero (*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05) (t-test). 图2和3同The same for Figs. 2 and 3.

进一步对非处女蝇的检测结果表明，与植物乳杆菌相比，酿酒酵母(P<0.01)和苹果醋酸杆菌(P<0.001)对非处女蝇的引诱更强，但在酿酒酵母和苹果醋酸杆菌之间没有显著差异(图2: A)。而与单一的植物乳杆菌或苹果醋酸杆菌相比，2种不同微生物的混合物或3种微生物的混合物都具有更强的吸引力；2种微生物的混合物对黑腹果蝇的引诱指数与单一酿酒酵母的相当，但3种微生物混合物的引诱指数显著高于单一酿酒酵母(P<0.001)。由此表明，与单一微生物相比，非处女蝇更趋向于不同微生物的混合物(图2: B-E)。

图2 不同微生物组合对黑腹果蝇非处女蝇的引诱指数Fig. 2 Attraction index of different microbe combinations to non-virgin Drosophila melanogasterA: 单一微生物与单一微生物比较 Single microbe versus single microbe; B-D: 两种微生物的混合物与单一微生物比较Mixture of two microbes versus single microbe; E: 3种微生物的混合物与单一微生物比较Mixture of three microbes versus single microbe.

2.2 不同微生物对黑腹果蝇产卵选择的影响

与在正常培养基(对照)上相比，黑腹果蝇非处女蝇都显著偏好于在添加植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的培养基上产卵(P<0.001)(图3: A)，该结果与非处女蝇对单一微生物的引诱实验结果一致，表明这3种微生物不仅可影响黑腹果蝇的觅食行为，也可影响其产卵选择行为。非处女蝇在2种不同微生物之间的产卵选择结果表明，与植物乳杆菌相比，黑腹果蝇更偏好于在含有苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的培养基上产卵(P<0.001)，而与酿酒酵母相比，黑腹果蝇更偏好于在含有苹果醋酸杆菌的介质上产卵(P<0.01)。由此可见，黑腹果蝇对3种微生物产卵选择偏好依次是苹果醋酸杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌(图3: B)。而与单一微生物相比，黑腹果蝇更偏好于在含有2种或3种不同微生物的混合物的介质上产卵(图3: C-F)，该结果与引诱实验的结果类似，表明黑腹果蝇更偏好于在微生物多样性更丰富的环境中产卵。

2.3 不同微生物对黑腹果蝇幼虫发育的影响

与在正常培养基(对照)中相比，黑腹果蝇幼虫在分别含有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌或酿酒酵母的培养基中发育更快，其中在含酿酒酵母培养基中发育最快，其次是含苹果醋酸杆菌，最后是含植物乳杆菌(图: 4)。由此表明，3种不同微生物都可以显著促进黑腹果蝇幼虫的发育。

图3 黑腹果蝇非处女蝇在不同微生物组合间的产卵指数Fig. 3 Oviposition index of non-virgin Drosophila melanogaster between different microbe combinationsA: 单一微生物与CK比较 Single microbe versus CK; B: 单一微生物与单一微生物比较Single microbe versus single microbe; C-E: 两种微生物的混合物与单一微生物比较Mixture of two microbes versus single microbe; F: 3种微生物的混合物与单一微生物比较Three microbes versus single microbe. 产卵指数Oviposition index (OI)=(O-C)/(O+C). O: 添加微生物一侧卵的数量Number of eggs at the side with microbe culture; C: 添加对照培养基一侧卵的数量Number of eggs at the control side.

图4 不同微生物对黑腹果蝇幼虫发育的影响Fig. 4 Effects of different microbes on the development of Drosophila melanogaster larvaeA: 在不同培养基上生长72 h的幼虫Larvae grown on different media for 72 h; B: 在不同培养基上生长72 h的幼虫体重Body weight of larvae grown on different media for 72 h. 图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示差异显著(P<0.05, Tukey氏多重比较检验). Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey’s multiple comparison test). 图6同The same for Fig. 6.

图5 酿酒酵母(A)、植物乳杆菌(B)和苹果醋酸杆菌(C)对黑腹果蝇幼虫到蛹发育的影响Fig. 5 Effects of Saccharomyces cerevisiae (A), Lactobacillus plantarum (B) and Acetobacter malorum (C)on the development of Drosophila melanogaster from larva to pupa将50粒黑腹果蝇卵移入分别接种了酿酒酵母、植物乳杆菌和苹果醋酸杆菌培养基中，每日8:00和20:00统计化蛹数，至全部化蛹。Fifty eggs of D. melanogaster were transferred to the media inoculated with S.cerevisiae, L. plantarum and A. malorum, respectively, the numbers of pupae were counted at 8:00 am and 20:00 pm every day until complete pupation. live: 活菌Living microbe; die: 灭活菌Inactivated microbe. 图中数据为平均值±标准误；不同字母表示差异显著(P<0.05)，ns表示无显著差异(P>0.05)(双因素方差分析)。 Data in the figures are mean±SE. Different letters indicate significant difference (P<0.05), while ns indicates no significant difference (P>0.05) (two-way ANOVA analysis).

与对照正常50头黑腹果蝇幼虫在卵移入第7.0天全部化蛹相比，酿酒酵母活菌培养的果蝇幼虫在第6.0天全部化蛹(图5: A)，其他培养基中的果蝇幼虫在第6.5天全部化蛹(图5： B和C)。由此表明，3种不同微生物的活菌和灭活菌都可以加快黑腹果蝇幼虫到蛹的发育。但苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的活菌和灭活菌对黑腹果蝇化蛹时间的影响又不相同，尤其是酿酒酵母，接种活菌的果蝇幼虫在第4.0天开始化蛹，接种灭活菌的果蝇幼虫在第5.0天开始化蛹，同一时间点的接种活菌的蛹的数量都高于接种灭活菌和对照(图5: A)。植物乳杆菌和苹果醋酸杆菌对黑腹果蝇幼虫发育的影响相似，接种活菌的果蝇幼虫都在第4.5天开始化蛹，接种对应灭活菌的果蝇幼虫其化蛹时间与对照相同，都在第5.0天开始，但在第5.5天之后，果蝇幼虫在接种植物乳杆菌或苹果醋酸杆菌灭活菌和活菌培养基中的化蛹数接近，但都高于对照组的(图5: B和C)。

2.4 不同微生物对黑腹果蝇幼虫中胰岛素信号通路基因表达的影响

与对照(正常培养基上)相比，在接种苹果醋酸杆菌的培养基上培养72 h的果蝇幼虫的InR表达量显著降低(P<0.05)；与此相反，InR在接种植物乳杆菌或酿酒酵母培养基上培养的果蝇幼虫中的表达量显著上升(P<0.05)，且前者的显著高于后者的(P<0.05)(图: 6)。由此表明，在不同培养基上培养72 h，苹果醋酸杆菌可激活黑腹果蝇胰岛素信号通路，酿酒酵母和植物乳杆菌可抑制胰岛素信号通路。

图6 不同微生物对黑腹果蝇幼虫中InR相对表达量的影响Fig. 6 Effects of different microbes on the relative expressionlevel of InR in Drosophila melanogaster larvae

3 讨论

未交配和交配后雌雄果蝇对酿酒酵母和植物乳杆菌的趋性一致性(图1: A)表明这两种微生物可影响黑腹果蝇的觅食，而二者对雌性非处女蝇的吸引力高于对雄性的(图1: B)，推测其可能也影响黑腹果蝇的产卵；而未交配和交配后雌、雄果蝇对苹果醋酸杆菌的趋性差异暗示其可能主要影响果蝇的产卵。其中苹果醋酸杆菌对交配前后雌、雄黑腹果蝇行为影响的差异目前暂未见报道。黑腹果蝇对单一微生物的产卵选择实验表明，植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母对果蝇的产卵选择都具有显著的吸引力，其中苹果醋酸杆菌的影响最大，酿酒酵母其次，植物乳杆菌最小(图3: A)。Qiao等(2019)的研究发现，果蝇非处女蝇对酿酒酵母和植物乳杆菌具有明显的趋向性，而对苹果醋酸杆菌则明显趋避；对单一微生物的产卵偏好与本研究结果一致，都表现为显著偏好。Fisher等(2017)的研究表明，果蝇对苹果汁培养基中培养的酿酒酵母和苹果醋酸杆菌具有显著的趋向性，但对植物乳杆菌的趋性不明显。由此推测，果蝇非处女蝇对苹果醋酸杆菌的趋性差异可能是由于不同实验室使用的培养基成分和培养条件的差异，造成培养物中相关代谢产物的差异，从而影响果蝇的选择偏好。

此外，通过检测黑腹果蝇对不同微生物及其混合物的觅食和产卵偏好，发现与单一微生物相比，黑腹果蝇更偏好于不同微生物的混合物。Fisher等(2017)的研究发现，酿酒酵母与苹果醋酸杆菌共同培养时会发生代谢产物的转变，相比单一微生物，黑腹果蝇更偏好于该两种微生物的混合培养物。苹果醋酸杆菌可利用植物乳杆菌产生的乳酸作为碳源，进而提供植物乳杆菌生长所必需的氨基酸和维生素，二者的互作可为宿主果蝇提供一系列代谢产物，从而促进果蝇在不良环境情况下的发育(Consuegraetal., 2020; Henriquesetal., 2020)。由此表明，微生物的多样性也可影响黑腹果蝇的取食和产卵行为。

通过检测不同微生物对黑腹果蝇幼虫发育的影响，发现植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母都可以促进黑腹果蝇幼虫的发育，其中以酿酒酵母和苹果醋酸杆菌的影响最大(图4)。已有研究表明，酿酒酵母和苹果醋酸杆菌可显著促进非处女蝇卵巢的发育，进而提高雌性果蝇的产卵量，而植物乳杆菌无明显影响(Qiaoetal., 2019)。此外，研究表明，果蝇成虫和幼虫对食物的偏好不同，雌性果蝇更偏好于在有利于成虫而非幼虫的介质上产卵(Cooper, 1960)。本研究结果进一步表明，黑腹果蝇选择在含有不同微生物的培养基上产卵，不仅有利于成虫发育，同时也有利于幼虫的发育。此外，3种微生物的活菌和灭活菌对果蝇幼虫到蛹发育的影响也各不相同，活菌主要在早期加快幼虫的化蛹，其中酿酒酵母活菌的影响最为明显(图5: A)，而主要作为营养底物的灭活菌主要在中晚期促进幼虫到蛹的发育(图5)，从而表明这些微生物不仅可作为营养底物促进黑腹果蝇发育，同时可能还与宿主果蝇存在不同程度的互作，在黑腹果蝇幼虫发育中发挥作用。

胰岛素信号通路是肠道微生物调控果蝇生长发育的主要途径，其可通过调节糖代谢、基因转录和蛋白翻译等促进细胞增殖和生长代谢等过程。通过检测胰岛素信号通路负调控基因InR在接种不同微生物后黑腹果蝇幼虫中的相对表达量，发现苹果醋酸杆菌可显著抑制黑腹果蝇幼虫InR的表达(图6)。研究表明，苹果醋酸杆菌可通过吡咯喹啉醌依赖性乙醇脱氢酶(pyrroquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenase, PQQ-ADH)依赖的氧化呼吸链产生的乙酸激活胰岛素信号通路，进而促进黑腹果蝇的生长发育(Shinetal., 2011; 李玉娟等, 2017b)。由此表明，苹果醋酸杆菌也可能通过胰岛素信号通路调控黑腹果蝇幼虫的生长发育。而酿酒酵母和植物乳杆菌可显著提高InR的表达，与二者促进黑腹果蝇幼虫发育的结果不一致。已有报道发现植物乳杆菌主要通过激活雷帕霉素靶蛋白(TOR)激酶活性，提高生长速率，促进黑腹果蝇幼虫的生长发育(Storellietal., 2011)，而不是胰岛素信号通路。但李玉娟等(2017a)分离并鉴定到一种植物乳杆菌L.plantarumFY1可激活胰岛素信号通路而非TOR信号通路，并促进黑腹果蝇生长发育，推测不同的植物乳杆菌菌株可能通过不同的分子机制调控果蝇发育。此外，早期研究认为酵母菌对果蝇发育的影响主要是提供果蝇生长发育所需要的底物(Anagnostouetal., 2010; Shinetal., 2011)，近年研究表明，酵母菌也可通过与果蝇的互作来影响宿主的生理活动和发育(Padilla, 2016)。本研究也发现酿酒酵母也可能通过与黑腹果蝇的互作影响果蝇的行为和幼虫发育过程，但其通过什么信号通路调控果蝇的生长发育，还有待进一步研究。

综上所述，本研究发现果蝇肠道微生物植物乳杆菌和苹果醋酸杆菌及环境中影响果蝇觅食的酿酒酵母均可影响黑腹果蝇的觅食偏好和产卵选择偏好，其中苹果醋酸杆菌主要影响黑腹果蝇的产卵，酿酒酵母和植物乳杆菌则可同时影响觅食和产卵，与单一微生物相比，黑腹果蝇在觅食和产卵选择中都更偏向于不同微生物的混合物。同时，这些微生物在不同程度上都可通过与黑腹果蝇的互作促进幼虫的发育，但其调控机制不同。该研究结果不仅丰富了肠道微生物参与调控宿主行为和发育的研究，同时为进一步研究不同肠道微生物与宿主互作的分子机制提供了依据。