气相色谱-质谱法检测益智药材中16种多环芳烃

孙细珍,杜佳炜，钱全全，吴平谷

(1.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室,湖北 黄石 435100；2.浙江省疾病预防控制中心， 浙江 杭州 310051)

PAHs的测定属于痕量分析，监测指标较多、理化性质差异大、检测难度较大。已有文献报道的PAHs检测方法多集中于土壤、水、空气以及烧烤食品等方面[13-16]，对于中药材等复杂基质样品中PAHs残留量测定方面的研究报道较少。目前PAHs检测中常用的样品前处理方法主要有液液萃取技术、皂化法、凝胶渗透色谱法、固相萃取法、柱净化-萃取联用技术[17-21]等净化方法，GB 5009.265-2016《食品安全国家标准 食品中多环芳烃的测定》中提供的检测方法不能有效分离苯并[j]荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽，且油脂净化效果较差[22]。益智药材因含有大量的挥发油而导致基质复杂，净化效果不佳时会严重影响目标物的测定重复性和准确度，因此需要建立一种净化效果良好、选择性强、检出限低的检测方法监测益智药材中的PAHs。

本文采用液液萃取法提取样品中的多环芳烃，通过联合使用皂化法和固相萃取法对提取液进行净化处理，进一步采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和稀释同位素内标法同时测定益智药材中的16种多环芳烃。该方法具有提取效率高、净化效果好的特点，能有效降低益智药材中复杂基质对多环芳烃目标物的干扰，具有较高的选择性、灵敏度、准确性，已成功应用于市售益智药材中16种多环芳烃的监控筛查。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

8批益智药材购自全国各药店，编号分别为YZ-1、YZ-2、YZ-3、YZ-4、YZ-5、YZ-6、YZ-7、YZ-8，所有样品均在阴凉、避光处储存。

固相萃取净化柱：二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺柱(DVB+PSA，500 mg/6 mL)、弗罗里硅土柱(Florisil，2 000 mg/12 mL)均购自杭州福裕科技有限公司；分子印迹柱(MIP，500 mg/6 mL)购自上海安谱实验科技股份有限公司。

PAHs标准溶液的配制：以丙酮-异辛烷(1∶1，体积比)为溶剂，将16种PAHs混标母液稀释成0.2 mg/L的标准储备液，7种PAHs同位素内标混合溶液稀释成4 mg/L的内标使用液，于4 ℃保存备用；采用丙酮-异辛烷(1∶1，体积比)稀释PAHs标准储备液，制备PAHs的系列标准曲线工作液(1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L)。

1.2 仪器与设备

8890-5977B 气相色谱质谱仪(配EI源with XTR，美国Agilent科技有限公司)；SPE-40自动固相萃取仪(天津伯纳艾杰尔公司)；摇摆式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；3K15高速离心机(美国Sigma司)；PURELAB Ultra超纯水机(英国埃尔格公司)；EFAA-DC24-RT氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；SQP千分之一电子天平(德国Sartorius公司)；DB-EUPAH毛细管色谱柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm，美国Agilent科技有限公司)。

1.3 样品前处理

取2.0 g益智药材样品(过三号筛)于50 mL离心管中，加入10 μL内标使用液，加入20 mL乙醇水溶液(1∶1，体积比)溶解后，再以10 mL正己烷超声提取5 min，在8 000 r/min下离心5 min。提取液先过Florisil柱固相萃取，用5 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1∶4，体积比)洗脱，洗脱液于40 ℃水浴下氮吹至近干，用3 mL 0.3 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液溶解，加入4 mL水和5 mL正己烷，在8 000 r/min下离心5 min。取有机相过MIP柱进行固相萃取，用5 mL二氯甲烷-乙酸乙酯溶液(1∶1，体积比)进行洗脱，收集洗脱液，在40 ℃水浴中用氮气缓慢吹干后，准确加入0.2 mL丙酮-异辛烷溶液(1∶1，体积比)，供GC-MS测定。样品前处理过程见图1。

图1 供试样品前处理流程Fig.1 Preprocessing flow for the test samples

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：DB-EUPAH毛细管色谱柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm)；进样口温度为280 ℃，载气为高纯氦气(纯度为99.999%)，流速为0.8 mL/min；升温程序为初温80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至315 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min 升至320 ℃，保持5 min；进样体积为2 μL，不分流进样。

质谱条件：电离源为EI with XTR源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，传输线温度为280 ℃，溶剂延迟为16.5 min，离子扫描范围为35～500 u。扫描方式：先采用全扫描模式(SCAN)确定16种PAHs与对应内标物(ISTD1、ISTD1……、ISTD7)的保留时间及特征离子，然后对目标化合物进行分组，采用选择离子模式(SIM)扫描，16种PAHs和7种内标物的保留时间、特征离子及SIM模式分组信息见表1。

表1 16种多环芳烃的色谱-质谱参数Table 1 GC-MS parameters for 16 PAHs

1.5 数据分析

应用SPSS 22.0对不同样本之间的最小显著差异进行单因素分析，α≤0.05被认为具有统计学差异；使用Origin 8.6对数据进行说明。

图2 16种PAHs混合标准溶液(200 μg/L) 的色谱图(SIM)Fig.2 Chromatogram of 16 PAHs mixture standard in SIM mode 1.BcFL；2.D12-BaA；3.BaA；4.D12-CHR；5.CHR； 6.CPP；7.MCH；8.D12-BbFA；9.BbFA；10.BkFA； 11.BjFA；12.D12-BaP；13.BaP；14.D12-IP； 15.D14-DBahA；16.IP；17.DBahA； 18.D12-BghiP；19.BghiP；20.DBalP； 21.DBaeP；22.DBaiP；23.DBahP

2 结果与讨论

2.1 气相色谱-质谱条件的优化

16种PAHs存在同分异构体现象，为获得良好的分离度和灵敏度，本研究对升温程序、柱流速、进样体积等仪器条件进行了优化(见“1.4”)。在优化条件下，16种PAHs与7种PAHs同位素内标物的SIM模式扫描图如图2所示。

2.2 萃取溶剂的选择

益智药材含有大量的挥发油且化学成分多样，而待测的16种PAHs极性范围宽、结构差异大，通常采用正己烷、二氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯或其混合物作为提取溶剂[23]，为了降低基质干扰，本实验参照文献[24]考察了正己烷、环己烷-乙酸乙酯(1∶1，体积比)和乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，体积比)共3种溶剂体系的提取效果，实验结果如图3所示。从图中可知，以乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，体积比)为提取溶剂时，16种PAHs的提取回收率为85.4%～108%，优于另外两种溶剂体系。因此本实验选择乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，体积比)作为提取溶剂。

2.3 净化条件的选择

由于益智药材基质复杂，检测过程中会产生较大的干扰峰，影响检测结果的灵敏度与准确度，因此净化是PAHs检测过程中的关键步骤。本实验分别对比DVB+PSA柱和MIP柱对加标量为10 μg/kg的16种PAHs的净化效果，结果如图4所示。从图可知，16种PAHs经DVB+PSA柱净化后的回收率为43.5%～123%，在MIP柱的回收率为78.1%～105%。结果表明DVB+PSA柱对部分PAHs具有基质增加效应，导致回收率过高。因此，本实验选择MIP柱作为净化柱。

图3 不同提取溶剂对益智药材中16种PAHs回收率的影响Fig.3 Effects of different solvents on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

图4 不同萃取小柱对益智药材中16种PAHs回收率的影响Fig.4 Effects of different SPE columns on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

实验过程中发现样品经皂化后再采用MIP柱进行净化处理，样液颜色较深，不仅对仪器系统产生较大的污染，而且存在一定的基质效应，影响检测结果的准确度，因此拟在皂化前增加Florisil净化步骤。本实验以益智药材为研究对象，通过对16种PAHs的加标回收实验(加标量为10 μg/kg)，对在皂化步骤前是否增加Florisil净化进行考察，实验结果如图5所示。从图可知，不进行Florisil柱净化时，16种PAHs的回收率为66.4%～139%。进行Florisil柱净化时，16种PAHs的回收率为85.4%～108%，且谱图的杂质峰数量明显减少，杂质响应显著降低。结果表明增加Florisil固相萃取可以提高净化效果，获得更佳的实验结果。因此，本研究确定在皂化前先进行Florisil柱固相萃取。

2.4 基质效应的评价

基质效应是指样品中除分析物以外的组分对检测过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。本研究采用Matuszewski等[25]建立的方法评价基质效应，即将同浓度的阴性基质标准溶液目标物响应值与纯溶剂标准溶液目标物响应值进行比较，比值等于1时，表明不存在基质效应；比值大于1时，表明存在基质增强作用；比值小于1时，表明存在基质抑制作用；比值介于0.8～1.2时，通常认为基质效应较弱，可以忽略[26]。实验选取阴性益智药材试样，按“1.3”处理后的基质样液分别配制质量浓度为50 μg/L和200 μg/L的基质混合标准溶液，与同浓度的纯溶剂混合标准溶液进行检测比较。结果表明，经Florisil-皂化-MIP联合净化后的两种样品基质中，16种PAHs目标物的比值为0.8～1.2，说明本方法的基质干扰较小，基质效应可忽略。

图5 Florisil净化柱对益智药材中16种PAHs回收率的影响Fig.5 Effects of Florisil SPE column on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

2.5 线性关系与检出限

在优化条件下，测定系列混合标准工作液，以各PAHs定量离子与对应内标物定量离子的峰面积比作纵坐标(y)，以相应的质量浓度比作横坐标(x,μg/L)绘制标准曲线，得到各PAHs的线性方程。以3倍信噪比(S/N=3)计算仪器检出限(LOD)，结合前处理条件的稀释倍数，确定方法的检出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)。实验结果见表2，16种PAHs在1.0～200.0 μg/L的质量浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99。4种二苯并芘的LOD为1.0 μg/kg，LOQ为3.0 μg/kg，其它12种PAHs的LOD为0.3 μg/kg，LOQ为1.0 μg/kg。

表2 16种PAHs的线性方程、r2、方法检出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of 16 PAHs

2.6 回收率与相对标准偏差

在优化条件下，选取益智药材样品YZ-4分别进行3个水平(LOQ，2×LOQ，10×LOQ)的加标回收和精密度实验，以中间添加水平连续实验3 d，考察方法的日间精密度。由表3可知，在加标浓度范围内，除苯并[c]芴(BcFL)的加标回收率为65.4%～72.8%，日内相对标准偏差(RSD，n=6)为6.0%～7.4%，日间RSD(n=6)为8.5%外，其他15种PAHs的加标回收率为89.3%～116%，日内RSD(n=6)为0.10%～6.1%，日间RSD(n=6)为1.2%～7.5%。结果表明，该方法准确可靠，可用于益智药材中16种PAHs的检测分析。

表3 16种PAHs的回收率与相对标准偏差Table 3 Determination results of recoveries and RSDs of 16 PAHs

2.7 实际样品的检测

将采集的8个益智药材样品(YZ-1～YZ-8)，采用本实验建立的方法测定16种PAHs的含量，结果如表4所示。从表中可知，8批益智药材样品中YZ-7和YZ-8中存在较高的PAHs，YZ-7样品中BaP含量为9.05 μg/kg，PAH4(BaA、CHR、BbFA、BaP的总含量)为128.66 μg/kg；YZ-8样品中BaP含量为9.90 μg/kg，PAH4含量为139.61 μg/kg。表明益智药材中存在较为严重的多环芳烃污染，鉴于所采益智药材样品中普遍检出PAHs化合物，需对益智药材开展PAHs化合物污染调查，如干燥方式的风险评估等。

表4 8批益智药材中的PAHs残留量结果(μg/kg)Table 4 Detection results of PAHs residues in 8 batches of Alpinia oxyphylla Miq samples(μg/kg)

*means the result below the LOD;PAH4 is the sum of contents of 4 kinds PAHs including BaA,CHR,BbFA and BaP

3 结 论

本文采用Florisil-皂化-MIP固相萃取柱联合净化技术，建立了气相色谱-质谱-稀释同位素内标法同时测定益智药材中16种PAHs的新方法。通过对仪器条件、萃取溶剂、固相萃取小柱及净化流程的优化，极大地降低了基质效应对检测结果的影响。在优化实验条件下，该检测方法在1.0～200.0 μg/L范围内线性关系良好，r2均大于0.99。所建立的方法净化效果良好，能有效降低复杂样品基质对检测结果的影响，方法的灵敏度与准确度高，适用于益智药材中PAHs的检测，可参考用于其它植物性中药材中16种PAHs的测定。