高效液相色谱-原子荧光光谱法测定农作物中无机硒的含量

张晓敏 郭颖超 刘 卫

(华北地质勘查局 五一四地质大队，河北 承德 067000)

前言

硒是人体所必需的微量元素之一，是组成人体谷胱甘肽过氧化酶十分重要的成分，具有延缓衰老，抗癌防癌，提高人体免疫力，拮抗重金属毒性，清除人体内有害自由基等功能，同时硒是典型的双功能元素之一，其生理需求量范围比较窄，日摄入量过低，会导致硒缺乏症；日摄入量过高又会导致硒中毒。中国预防医学科学院经过长期大量的调查研究发现，我国一般居民饮食中最低硒供给量为22 μg/d，而最高硒的安全摄入量为400 μg/d。因此，控制硒的摄入量在安全量范围内就显得十分重要。硒通过食物链进入人体，硒的存在形式决定其对人体的作用，其中有机硒起到有益作用，无机硒摄入过量会引起人体中毒。无机硒又包括亚硒酸盐Se(Ⅳ)和硒酸盐Se(Ⅵ)。最近几年来，随着人们生活水平的提高和健康保护意识的增强，富硒农作物以及富硒食品越来越受到消费者青睐。但是，由于富硒农作物以及富硒食品的加工、生产方式不同，农作物以及富硒食品中硒的存在形态也有很大差异，特别要关注的是一些商家直接将无机硒加入农产品中，可能对消费者健康产生极大的危害。因此，十分有必要对农作物中硒的价态进行分析。实验着重研究农作物中无机硒包括Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)含量的测定[1-6]。

目前，测定农作物中无机硒的方法有气相色谱(GC)法，液相色谱(LC)法，毛细管电泳(CE)法，高效液相色谱-原子荧光光谱(HPLC-AFS)法以及高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法。本文采用高效液相色谱-原子荧光光谱法测定农作物中的无机硒含量。该方法具有操作相对简单、检测成本较低、实验数据准确、精密度高的特点，适宜推广应用[7-10]。

1 实验部分

1.1 仪器设备

AFS 8500高效液相色谱-原子荧光仪(北京海光仪器有限公司)，自动进样器(北京海光仪器有限公司)，语路KQ-100 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，L580离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，BSA124S电子天平(北京赛多利斯电子天平有限公司)，XH-C快速混匀器(常州楚新仪器制造有限公司)，Athena C18-WP 保护柱(上海安谱科学仪器有限公司)，Athena C18-WP液相色谱柱(上海安谱科学仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

实验所用水为去离子水，磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸铜、四丁基溴化铵、碘化钾、氢氧化钾、硼氢化钾、甲酸均为分析纯，甲醇为色谱纯。

浸提剂：磷酸二氢钾溶液(0.1 mol/L)+硫酸铜溶液(1.56 mol/L)；

流动相：甲醇(5%)+磷酸氢二铵(25 mmol/L)+四丁基溴化铵溶液(0.5 mmol/L)，需要用0.45 μm滤膜过滤后，调节pH值，超声脱气后使用。

氧化剂：碘化钾(1%)+氢氧化钾溶液(0.5%)，现用现配。

还原剂：硼氢化钾(2%)+氢氧化钾溶液(0.5%)，现用现配。

载流：盐酸溶液(10%)，现用现配。

亚硒酸根标准储备溶液Se(Ⅳ，1 000 μg/mL，GFGG-060034-08-01，上海安谱实验科技股份有限公司)，硒酸根标准储备溶液Se(Ⅵ，1 000 μg/mL，GFGG-060034-09-01，上海安谱实验科技股份有限公司)。

Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)标准溶液(1.00 μg/mL)：分别移取100 μL Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)标准储备溶液分别于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

分别取Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)浓度为1 μg/mL的标准溶液0、1、5、10、20、50、100 μL转入1 mL进样瓶中，分别加入1 000、999、995、990、980、950、900 μL流动相混匀后，待测。

1.3 样品前处理

准确称取农作物样品2.0 g(精确至0.000 1 g，固体粉末)于10 mL离心管中，加入10 mL浸提液，充分浸取混匀后，于70 ℃超声清洁仪里超声30 min，4 500 r/min离心机上离心10 min，用0.45 μm滤膜过滤后收集于自动进样瓶中，待测。

1.4 仪器工作条件

AFS 8500原子荧光光谱-高效液相色谱仪工作参数，见表1。

表1 AFS 8500原子荧光光谱仪-高效液相色谱工作参数Table 1 AFS 8500 atmic fluoresence spectrum high-performance liquid chromatography working parameters

2 结果与讨论

2.1 流动相pH值对保留时间的影响

流动相pH值是影响保留时间的一个非常重要的因素，pH值变化，使得流动相的极性发生变化，因此，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间也会随着发生变化。考察了不同pH值对农作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)保留时间的影响，见图1。

图1 流动相pH值对保留时间的影响Figure 1 Effect of mobile phase pH on retention time.

通过实验发现，随着流动相pH值的增大，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间也随之增加。因此实验选择最佳的pH值为6.0。

2.2 流动相甲醇浓度对保留时间的影响

对于C18柱，增加流动相中甲醇的浓度，保留时间也会随之发生变化，考察了不同流动相浓度下对保留时间的影响，如图2所示。

图2 流动相甲醇浓度对保留时间的影响Figure 2 Effect of mobile phase methanol concentration on retention time.

从图2可以看出，随着流动相甲醇浓度的不断增大，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间逐渐缩短，选择流动相甲醇浓度5%作为最佳的实验条件。

2.3 超声时间对浸出率的影响

超声时间不同，会影响农作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 的浸提效率，考察了随着超声时间的变化，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的回收率情况，如图3所示。

由图3可以看出，随着超声时间的增加，农作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的回收率逐渐增大，当达到30 min 后，不随着超声时间的增长发生变化，因此，选择超声时间30 min为最佳超声时间。

图3 超声时间对Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)回收率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic time on recovery of Se(IV)and Se(VI).

2.4 载流对保留时间的影响

载流HCl的浓度对Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间有一定影响，考察了不同的载流HCl浓度对农作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)保留时间的影响。

通过图4实验发现载流HCl的浓度对Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间有一定的影响，随着载流HCl浓度的增加，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间逐渐减小，当载流HCl的浓度为10%以上后，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间不再有明显变化。因此，选择载流HCl的浓度为10%作为最佳。

图4 载流HCl浓度对Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间的影响Figure 4 Effect of current-carrying HCl concentration on the retention time of Se(IV)and Se(VI).

2.5 最佳条件下Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分离效果

在流动相pH值为6.0、流动相甲醇浓度为5%、样品超声时间为30 min、载流HCl的浓度为10%条件下，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分离效果见图5。

图5 最佳条件下Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分离效果图Figure 5 Separation of Se(IV)and Se(VI) under optimal conditions.

从图5 中农作物Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分离效果可以看出，本方法中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留时间分别为2.60 min和3.80 min，大大提高了生产效率，节约了生产成本。

2.6 标准曲线的绘制和检出限

按照方法所述实验条件对Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的标准溶液系列进行测定，并绘制出标准曲线，结果表明：Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的浓度在0～100 μg/L范围内与其对应的峰面积呈一定的线性关系，线性回归方程、标准曲线的相关系数见表2。

表2 线性回归方程、标准曲线、相关系数和检出限Table 2 Correlation coefficient and detection limit of linear equation and standard curve

2.7 方法精密度与加标回收实验

按实验方法对已知本底值的样品进行加标回收实验，计算加标回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

表3 精密度和回收率实验结果Table 3 Results of precision and recovery tests(n=7)

通过对已知本底值的样品进行精密度(n=7)实验和加标回收率实验，加标回收率在91.5%～96.3%，RSD在 5.8%～8.2%。

3 结论

采用高效液相色谱-原子荧光光谱法对农作物中的Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)进行测定，具有操作简单、检测成本低、分析数据准确，精密度高，回收率好的特点，适用于农作物中无机硒的大批量样品测试。