HPLC法测定苹果中游离糖组成及含量*

许海菊，李玉红

（咸阳师范学院 化学化工学院，陕西 咸阳712000）

随着人们生活质量的提高，与日常生活息息相关的日用品、食物、水果中的一些营养物质的含量也是人们关注的焦点之一，因为糖类与人们的生活和健康有着密不可分的关系，所以对于水果中糖类含量的检测是非常有必要的。苹果在我国境内有大面积的种植，已成为最受欢迎的水果之一[1]。苹果果肉含有丰富的营养物质，这些营养成分对人体健康具有重要作用，深入了解苹果果实中游离糖的种类以及含量，有助于提高人们对苹果的认知与重视程度，改变不良饮食习惯与消费习惯[2]。目前，关于游离糖测定方法有很多种，比如，酶电极法[3]、气相色谱法[4]、化学分析法[5]、毛细管电泳法[6]、高效液相色谱法[7]等，而高效液相色谱法相比于其他几种方法具有很多优点[8]，所以此次实验将采用高效液相色谱法来分别测定咸阳苹果、黄苹果、青苹果、洛川苹果和蛇果这5种苹果果实中的游离糖种类以及各自的糖含量，比较分析每种苹果中蔗糖、果糖、葡萄糖的含量，为不同的人群提供合理选择苹果的理论基础。

1 实验部分

1.1 药品试剂与仪器设备

果糖、蔗糖、葡萄糖、乙腈，均为分析纯，天津市红岩化学试剂厂；无水甲醇、无水乙醇，均为分析纯，上海化学试剂厂；蛇果，黄苹果，青苹果，洛川苹果，咸阳苹果（市售）。

LC10Avp型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Arium-61L型超纯制水机（德国Sartorius公司）；SEDEX75型蒸发光散射检测器（法国Dikma公司）。

1.2 样品处理及溶液的配制

用超纯水分别将咸阳苹果、黄苹果、青苹果、蛇果和洛川苹果清洗干净，进行削皮、去芯后用分析天平称量咸阳苹果141.8035g，黄苹果95.2406g，青苹果137.8853g，蛇果97.8156g，洛川苹果100.3615g。分别加入20mL超纯水，放入干净的榨汁机中榨汁。用移液枪吸取一定量的每种样品汁液3份于100mL的容量瓶中，进行30min超声处理。定容，摇匀，离心，时间约为15min。将离心管中的上清液用一次性医用针管吸取一定质量，用0.45μm的过滤膜过滤，将滤液置于试剂瓶中并编号用于高效液相色谱分析测定。

1.3 标准曲线的绘制

称取蔗糖804.4g、葡萄糖701.3g、果糖699.0g置于同一烧杯中；加适量的超纯水使固体全部溶解；将所得的混合标准溶液转移至100mL的容量瓶中定容，摇匀，用移液枪将上述配制好的标准溶液分别移取0.5、1、2、3、4mL于5个25mL的比色管中，用超纯水定容。按照最佳色谱条件进样测试，在显示器上读出每一个样品在色谱图中的峰面积，根据每种游离糖的峰面峰面积和浓度的对应关系计算线性回归方程，得出标准曲线。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curves

2 结果与讨论

2.1 流动相配比的选择

当乙腈-水的体积比为60∶40和70∶30时，色谱图上只出现果糖和葡萄糖的峰并没有出现蔗糖的峰，因此，这两种配比不满足实验要求，只有当乙腈-水的体积比为80∶20时，在色谱图中出现果糖、葡萄糖、蔗糖的3个峰。

图2 流动相配比对游离糖测定的影响Fig.2 Effect of flow matching ratio on determination of free sugar（1.fructose 2.glucose 3.sucrose）

2.2 最佳柱温的选择

图3 柱温对游离糖测定的影响Fig.3 Effect of column temperature on determination of free suga

为了使样品中3种游离糖有更好的分离效果，必须选择一个最佳的柱温来对样品进行检测。选择温度梯度设置为20、30、40、50和60℃，在此温度梯度条件下对样品溶液进行测定，通过测定柱温为50℃时，3种游离糖可以完全分离且分离效果好。

2.3 流动相流速的选择

本次实验将流速梯度设定为0.4、0.6、0.8和1mL·min-1。经过实验对比发现在流速为1mL·min-1时3种峰能够完全分离。

图4 流速对游离糖测定的影响Fig.4 Effect of flow velocity on the determination of free sugar

2.4 精密度的测试

精密度是指在相同条件下，多次测定同一样品[9]。在最佳色谱条件下，对同一样品多次测定，采用峰面积的相对标准偏差表示精密度[10]。计算得知：果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积的相对标准偏差分别为2.91%、2.38%、2.54%。

表1 平行测定峰面积数据Tab.1 Parallel determination of peak area data

2.5 样品定性分析

根据3种糖的保留时间不同，将混合标样色谱图与3个单糖的色谱图分别进行比较，可知第一个出峰的是果糖，第二个出峰的是葡萄糖，第三个出峰的是蔗糖。

图5 标样色谱图Fig.5 Chromatogram of sample

图6 黄苹果色谱图Fig.6 Chromatogram of Yellow apple

图7 青苹果色谱图Fig.7 Chromatogram of Green apple

图8 蛇果色谱图Fig.8 Chromatogram of snake fruit

图9 洛川苹果色谱图Fig.9 Chromatogram of Luochuan apple

图10 咸阳苹果色谱图Fig.10 Chromatogram of Xianyang apple

2.6 苹果样品中游离糖的含量分析

根据果糖、葡萄糖、蔗糖的标准曲线方程和各自的平均峰面积可以求出样品溶液中总含糖量[11]，再根据样品溶液总含糖量便可求出5种苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

表2 苹果中各种游离糖的含量（g·100g-1）Tab.2 Contents of various free sugars in apples（g·100g-1）

3 结论

本实验采用高效液相色谱法，在色谱柱为氨基色谱柱，流动相为乙腈-水，其体积比为20∶80，流速1mL·min-1，柱温50°C，进样量20μL，N2压强3.5bar，提取剂为超纯水的条件下，测得苹果果实中的可溶性游离糖主要为果糖、葡萄糖、蔗糖。从实验数据中可得出：青苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分别为7.83%、4.47%、1.69%；黄苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分别为6.67%、3.34%、1.27%；蛇果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分别为10.52%、4.58%、1.91%；洛川苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分别为12.52%、4.657%、1.123%；咸阳苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖含量分别为9.47%、3.87%、2.94%。本次实验所选的苹果中，果糖含量最高，其次是葡萄糖，最少的是蔗糖。经计算洛川苹果中的总糖含量是最高的，黄苹果中糖含量是最低的。其他的3种苹果中糖含量差距不大。经过此次实验的测定可以得出各种苹果的含糖量，为人们在身体状况不同时提供更好的选择依据，也可为其他的水果研究提供一定的参考价值。