HPLC法测定清心莲子饮中京尼平苷酸的含量*

陈忠新，苟鑫宇，牟景龙，解 颖，李 强

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨150069）

清心莲子饮是国家发布的第一批《经典名方目录》方药之一，来源于《太平惠民和剂局方》，具有清心火，益气阴，交心肾、清热利湿、益气扶正、生津、收敛浮阳之功效[1]。主治：小便白浊，便赤如血，口舌干燥渐成消渴，男子五淋，妇人带下赤白及病后气不收敛，五心烦热。现今临床仍广泛应用，多用于治疗肾脏疾病及尿路感染等[2-4]。

该方由九味中药组成，其中车前子清热利湿为方中臣药，其有效成分环烯醚萜类京尼平苷酸具有抗炎作用[5,6]。本研究以京尼平苷酸为指标性成分，采用HPLC测定其含量，为清心莲子饮的后续研究及应用奠定了基础。

1 仪器、试药及药材

1.1 仪器

ThermoU3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）;AB204-N型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;KQ-500D型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）;GLZY-0.5B型真空冷冻干燥机（上海浦东冷冻干燥设备有限公司）。

1.2 试药及药材

购自中检所的京尼平苷酸对照品（批号：111828-201403）；色谱甲醇采购于迪马科技有限公司；甲醇、HAc等分析纯试剂均购自天津天大化学试剂有限公司；方中九味药材均为道地药材，其中车前子购自河北省沧州市。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选用Elite HPLC C18（4.6×25mm，5μm）色谱柱，以甲醇-0.5% HAc（体积比5→32∶95→68）为流动相进行梯度洗脱，将检测波长设定为254nm，柱温采用30℃，流速设置为1.0mL·min-1。

2.2 供试品溶液的制备

按《太平惠民和剂局方》记载，称取莲子30g、黄芩20g、车前子20g、茯苓30g、麦冬20g、地骨皮20g、炙黄芪30g、人参30g、炙甘草20g。混和粉碎过筛并混匀，称取粗粉12g，加麦冬3g，300mL水煎煮两次，每次1h，得240mL标准煎液。制备成冻干粉，备用。精取冻干粉0.22g，用20mL 60%甲醇超声溶解20min，滤过，蒸干，甲醇定容至10mL容量瓶中，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取京尼平苷酸对照品4.5mg，甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，制成浓度为0.09mg·mL-1的标准品溶液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

称取处方中除车前子外的其他八味药材，按2.2项下方法制备成阴性对照样品溶液。

2.5 专属性考察

按2.1项下色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照液，进行色谱测定，结果在246nm条件下，对照品溶液及供试品溶液在相同的保留时间呈现一致的特征峰，而阴性样品溶液无对应色谱峰，因此说明，阴性对照样品对京尼平苷酸的测定无干扰。色谱图见图1。

图1 对照品、供试品及阴性对照色谱图Fig.1 Chromatograms of standard,test sample and negative control

2.6 线性关系考察

精密吸取2.3项下京尼平苷酸标准品溶液各2、4、6、8、10μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定。以含量为X轴，峰面积比值为Y轴进行线性回归，得标准曲线回归方程为Y=11.185X+0.065，R2=0.9999。结果表明京尼平苷酸含量在0.18～0.90μg之间线性关系良好。

2.7 精密度考察

取2.2项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续重复进样测定6次，每次10μL，计算京尼平苷酸峰面积的RSD值为0.76%（RSD＜3%），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性考察

分别量取2.2项下各冻干粉0.22g按后续方法进行处理，制成6份供试品溶液，各进样10μL，测得京尼平苷酸平均值为4.8025mg·剂-1，RSD值为2.65%（RSD＜3%），表明方法重复性良好。

2.9 稳定性考察

取配制好的同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、12h各进样10μL，测得京尼平苷酸峰面积RSD值为2.59%（RSD＜3%），表明样品在配制完成后的12h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验

精密称取2.2项下制备的6份清心莲子饮冻干粉各0.11g，分别加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸标准品溶液各1mL，制备成供试品溶液，测定条件参照2.1项，每次进样量同上，计算回收率，结果符合加样回收率要求，见表1。

2.11 样品含量测定

分别取不同批次的清心莲子饮冻干粉各0.22g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液。分别取10μL注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算京尼平苷酸含量。3批样品京尼平苷酸含量分别为4.8244、4.8770和5.0073mg·剂-1，考虑到实验误差的存在，各基准物质含量略有差异，在合理的波动范围之间。

3 结论

清心莲子饮化学成分复杂，车前子为方中臣药，京尼平苷酸为车前子的主要有效成分。本实验建立了一种高效液相色谱方法，并对实验方法进行了方法学考察，并用该方法对3个平行批次样品中该指标性成分的含量进行了测定，结果表明，本实验方法比较成熟，科学合理，稳定可靠，重复性好，在线性范围内具有良好的灵敏度和加样回收率，为清心莲子饮有效成分的含量测定、质量控制以及临床的合理应用提供了实验依据和理论支持。