促红细胞生成素对老年性聋小鼠炎性因子的调节作用

秦雪梅,孙 青*,曹德林,李菊红,高 萍,郭志强

(1 复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科,上海 201700;2 上海市青浦区朱家角人民医院耳鼻喉科;*通讯作者,E-mail:13611976156@163.com)

老年性聋是指听觉器官随着年龄的增长而老化和退化,导致双耳的感音神经性听力损失。在此过程之中,首先是高频,逐渐发展为中低频,同时相应的言语辨别能力也会出现比较明显的下降,值得注意的是,言语辨别力的损失相对较高,即言语识别率的阈值高于语音区域中纯音的阈值[1]。造成老年性聋的因素涉及多方面,包括生理学、病理学、生物化学和分子学,相对应的发病机制也非常复杂,是多种因素共同作用之后所得到的结果。随着全球老龄化问题的日益突出,全社会越来越重视老年性聋,学者们也借助多种先进手段对老年性聋的发病机制进行了越来越深入的探索。但是,目前对其发病机制尚未完全理解,这使得在老年性聋的预防和治疗方面难以取得重大突破。

近年来,研究表明耳蜗是老年性耳聋发生后最容易受损的部位,耳蜗受血流的影响非常明显,即便只出现轻微的血液微循环变化,也可能损伤内耳功能。而血脂代谢状况、凝血功能状况对机体血液微循环有着非常重要的影响。促红细胞生成素(EPO)是一种激素糖蛋白分子,可以促进机体血液微循环,主要由胎儿肝脏和成年人肾脏产生,是具有分子量46 kD的糖蛋白细胞因子。近年来,研究发现[1]促红细胞生成素和血管内皮因子对分化和成熟细胞(例如神经细胞)具有明显的保护作用,并且它们的神经保护作用可以通过抑制细胞凋亡来实现,能够使得促炎细胞因子,如白介素(IL)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的正常表达以及分泌受到明显抑制,在中枢神经系统缺血缺氧性损伤、视网膜疾病和癫痫中起重要的神经保护作用[2-4]。也有研究结果证实,对于因使用庆大霉素或者缺血而导致的神经细胞以及毛细胞,EPO可以起到有效的保护作用[5]。基于以上研究基础,我们建立老年性聋小鼠模型,应用EPO进行干预,探讨其对血清和耳蜗中TNF-α、IL-6和IL-17的调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5周龄清洁级昆明小鼠60只,体质量(22±2)g,雌雄不限,耳廓反射正常,由南京大学动物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分组 小鼠在常温安静状态下喂养,自由饮水,给与7 d的适应性喂养。标记称重后,随机分为空白对照组和造模组。造模组进一步随机分为EPO组、生理盐水组和模型组,每个组各15只小鼠。

1.2.2 造模方法 参考相关文献[6-9],每只小鼠腹腔注射浓度为150 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液,每日1次,连续60 d。

1.2.3 干预方法 EPO组和生理盐水组分别进行腹腔注射1 000 U/kg EPO和等量生理盐水,均为2次/周,共8周。

1.2.4 标本采集 治疗结束后,小鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,沿腹中线剪开腹部,于下腔静脉处,抽取2 ml静脉血,离心后分离血清,置于-80 ℃冰箱中冻存,备用。

将小鼠耳蜗及前庭组织切除后,置液氮中10 min,匀浆机低速匀浆3 min,冰浴1 min,重复操作至组织完全裂解,冷凝处理后,以2 000 r/min的转速离心20 min,取上清液于-80 ℃的冰箱中冻存。

1.3 指标检测

1.3.1 ABR听力测试 用药前及停药后,在隔音、屏蔽的房间内,用YJC-A诱发电位仪测量清醒小鼠的听觉脑干反应[10]。将小鼠固定,引导电极放置在头骨的顶部,参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧乳突上,并用短声刺激。声音刺激器输入波幅为0.1 ms的方波电脉冲,并通过耳机输出,10次/s。以Ⅳ波刚出现时的刺激强度dB值为听觉脑干反应(ABR)的阈值。

1.3.2 ELISA法测定蛋白表达 采用ELISA法进行检测血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表达,严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。利用ELISA酶标仪(ELX800)450 nm波长读取每孔吸光度值。以标准曲线计算OD值和各项指标的血清含量。

1.3.3 免疫组织化学检测蛋白阳性率 采用免疫组织化学技术进行检测。取耳蜗组织制作石蜡切片,切取厚度为3 μm,按照所设定好的实验步骤进行严格操作。DAB、IL-6和IL-17的一抗、二抗以及TNF-α均购自上海安妍生物有限公司。使用光学显微镜对相应的染色结果进行观察以及拍摄。如细胞颜色呈现棕黄色,则属于阳性结果。随机抽取3个上皮细胞分布区,分别对着色强度以及阳性率作出客观评分。阳性率<25%,25%-50%,51%-75%,>75%分别对应1分,2分,3分,4分。着色强度无明显着色、浅黄色、棕黄色、黄褐色分别对应着0分,1分,2分,3分。两者得分之和≤2分者为阴性,>2分者为阳性,计算阳性率。

采用实时荧光定量PCR法进行检测。引物由上海云序生物科技有限公司合成(见表1),相关试剂产自美国ABP Biosciences公司。严格按照说明书进行操作。反应体系:94 ℃ 5 min,循环1次;94 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,循环15次;93 ℃ 25 s,60 ℃35 s,72 ℃ 20 s,反复35次。在60 ℃完成对信号的有效收集以及对相应Ct值的有效读取,通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对水平。

表1 引物信息

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ABR阈值比较

干预前模型组和空白对照组间ABR阈值具有显著性差异(P<0.05),说明造模成功。使用EPO进行干预后,EPO组ABR阈值较干预前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而生理盐水组在EPO干预前后ABR阈值无明显差异。EPO组干预后的阈值明显低于生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

2.2 各组血清中TNF-α、IL-6和IL-17表达比较

ELISA结果显示:模型组血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量明显高于空白对照组(P<0.05);生理盐水组与模型组间血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量无明显差异(P>0.05);与生理盐水组比较,EPO组血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量显著降低(P<0.05,见表3)。

表2 各组小鼠ABR阈值变化 (dB SPL)

2.3 各组耳蜗组织中TNF-α、IL-6和IL-17表达阳性率比较

免疫组化结果显示:模型组IL-6、IL-17以及TNF-α阳性率明显高于空白对照组(P<0.05);生理盐水组与模型组间IL-6、IL-17以及TNF-α阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与生理盐水组比较,EPO组耳蜗组织中IL-6、IL-17以及TNF-α的阳性率显著降低(P<0.05,见表4)。

2.4 各组耳蜗组织中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表达比较

实时荧光定量PCR结果显示:模型组耳蜗组织中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表达明显高于空白对照组(P<0.05);生理盐水组耳蜗组织中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相对表达与模型组比较,无显著差异(P>0.05);与生理盐水组比较,EPO组耳蜗组织中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相对表达显著降低(P<0.05,见表5)。

表5 耳蜗组织中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表达比较

3 讨论

老年性耳聋主要与内部环境稳定性的下降以及生物体器官、组织和细胞的功能和结构随着年龄的增长而退化有关,有研究表明炎症可能是老年性耳聋病理改变的重要机制[11,12]。健康动物或者健康老年人的血清当中存在着包括TNF-α以及IL-6在内的高水平促炎性细胞因子[13]。多项实验数据表明TNF-α以及IL-6促炎性细胞因子与多种年龄相关性疾病之间存在着非常密切的关系。本研究结果显示,EPO组与生理盐水组相比,TNF-αIL-6和IL-17的mRNA表达量明显降低。这说明EPO干预能够使得老年性聋小鼠模型相应的耳蜗组织以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的正常表达受到抑制,从而实现对局部炎症反应的有效预防和缓解。分析原因可能是老年性聋小鼠相应的耳蜗组织以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的含量及表达水平都比正常小鼠超出很多,这些因子的高表达可能代表着局部炎症损伤[14-17]。在受到EPO的干预之后,相对应的表达水平会出现明显下降,表明其能有效减弱局部炎症反应[18-21]。有研究结果证实,由噪音导致的耳聋患者或者由于免疫介导而导致的内耳疾病患者的耳蜗组织中,包括IL-10以及IL-6和TNF-α在内的各种促炎细胞因子与正常人相比明显高表达[22]。这些结果进一步证实了促炎细胞因子与耳聋具有密切的联系。

近年来,研究成果已证实了EPO能够有效抑制炎症反应和细胞凋亡,促进血管生成,同时还具有比较强大的神经保护功能[23,24]。另外还有部分研究证实EPO能够使得线粒体的稳定状态得以保持,从而减少局部细胞的凋亡[25]。本文实验结果也显示EPO对TNF-α、IL-6和IL-17的表达有明显的下调作用,这表明EPO可能有效抑制了炎症反应。但目前对IL-6和IL-17以及TNF-α在小鼠耳蜗组织当中复杂的作用机制还没有足够清晰的研究与阐明,需要本课题组后续进一步的研究。