miR-7156-3p在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

刘 敏,张 弘,程 丰,张茂娜,赵涓涓

(1 湖北省鄂州市中心血站,鄂州 436000;2 鄂州市中心医院检验科;3 鄂州市中心医院病理科;*通讯作者,E-mail:zhangh2316@sina.com)

乳腺癌是女性群体中最常见的恶性肿瘤,其发病率逐年上升[1]。尽管乳腺癌的诊断和治疗手段已有了很大的进步,仍有众多乳腺癌患者的预后较差[2]。乳腺癌细胞的快速增殖和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。寻找新的分子诊断标志物和治疗靶点,已成为乳腺癌研究领域的重要方向。在人体各个细胞中存在大量微小RNA(miRNA),其通过靶向结合靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻译区,降解靶基因mRNA或抑制其翻译,负向调控靶基因的表达[4,5]。miRNA在细胞的分化、增殖、转移、衰老、凋亡等生物学行为中发挥重要作用,参与调控包括肿瘤在内的多种疾病的发病与进展[6,7]。miR-7156-3p是miRNA家族的重要一员,在神经胶质瘤中异常低表达,发挥抑癌基因的作用[8]。目前,关于miR-7156-3p在乳腺癌中的表达和调控机制尚不清楚。本研究通过分析miR-7156-3p在乳腺癌患者血清和乳腺癌细胞株中的表达情况,探讨miR-7156-3p影响乳腺癌细胞增殖和迁移的调控机制,以期为乳腺癌的诊断和治疗提供新的分子标志物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 血清样本

收集2018年8月至2020年7月于鄂州市中心医院进行手术治疗的乳腺癌患者术前血清样本42例,以2019年2月至2019年10月于鄂州市中心医院体检中心的健康体检者血清样本42例作为对照。所有乳腺癌患者术前均未接受放疗、化疗或生物治疗。血清储存于-80 ℃冰箱内存贮。本研究经鄂州市中心医院伦理委员会审批通过,所有患者及健康体检者均签署知情同意书。

1.2 细胞株及主要试剂

RAB1A野生型质粒(RAB1A-WT)、RAB1A突变体质粒(RAB1A-MUT)、miR-NC、miR-7156-3p模拟物购自广州锐博生物科技有限公司;人正常乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549购自中国典型培养物保藏中心。RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司。LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。qPCR引物由上海生物工程股份有限公司合成。qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。Transwell小室购自美国Corning公司。GAPDH、RAB1A、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗体购自英国Abcam公司(蛋白编号分别为ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。

1.3 细胞培养与转染

采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养MCF10A和MB-MDA-468细胞,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养HCC1937、MCF7、SKBR3、BT549细胞,在含5%CO2的37 ℃培养箱中培养,胰酶消化并传代。将对数生长期的HCC1937细胞平铺于6孔板,当细胞融合度达30%时,将HCC1937细胞随机分为miR-NC组和miR-7156-3p组,根据LipofectamineTM3000试剂说明书进行瞬时转染,分别转染miR-NC和miR-7156-3p模拟物。转染48 h后,进行后续实验。

1.4 qPCR检测血清或细胞中miR-7156-3p和RAB1A mRNA的表达

向待测血清或细胞中加入Trizol裂解液,分别提取总RNA,并进一步逆转录为cDNA。配制20 μl的qPCR反应体系进行扩增检测。qPCR引物见表1。采用2-ΔΔCt分析计算miR-7156-3p或RAB1A mRNA的相对表达量。miR-7156-3p检测以U6为内参,RAB1A mRNA检测以GAPDH为内参。

表1 qPCR引物序列

1.5 MTT法检测两组HCC1937细胞增殖能力

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整两组HCC1937细胞密度为1.5×104个/ml,以150 μl/孔接种96孔板,每组4个复孔。分别在细胞贴壁1,2,3,4,5 d加入20 μl浓度为5 g/L的MTT试剂,培养箱内培养4 h,弃上清,加入150 μl/孔的二甲基亚砜,振荡保证晶体溶解,酶标仪检测两组HCC1937细胞在490 nm波长处的吸光值。实验重复4次。

1.6 Transwell小室实验检测两组HCC1937细胞迁移能力

采用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基调整两组HCC1937细胞密度为1.8×104个/ml,以200 μl/孔接种于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基600 μl,于培养箱内培养24 h。取出Transwell小室上室,采用棉签小心擦去未穿过的细胞。加入多聚甲醛进行固定,加入结晶紫进行染色,采用磷酸盐缓冲液洗涤并晾干。于倒置显微镜下,每组随机选取4个视野,计数穿过的细胞数并取平均值。实验均重复4次。

1.7 生物信息学预测miR-7156-3p的靶基因

本研究以MicroT-CDS预测网站预测miR-7156-3p可能的靶基因,以OncoLnc预后分析网站分析其靶基因表达水平与乳腺癌患者生存期的关系。

1.8 双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-7156-3p的靶基因

将对数生长期的HCC1937细胞随机分为4组,分别共转染RAB1A-WT+miR-NC、RAB1A-WT+miR-7156-3p、RAB1A-MUT+miR-NC和RAB1A-MUT+miR-7156-3p。培养箱内培养48 h后,参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书,分析4组细胞的相对荧光酶活性。实验重复4次。

1.9 Western blotting检测RAB1A及下游蛋白表达

向两组HCC1937细胞加入裂解液充分裂解40 min,离心获得细胞总蛋白。每组上样50 μg至聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE),110 V恒压电泳1.5 h。以200 mA恒流转膜至硝酸纤维膜。于5%脱脂牛奶中封闭2 h,加入一抗在冰箱内孵育过夜,加入二抗在室温孵育2 h。均匀滴加增强化学发光试剂,在凝胶成像系统中显影并拍照。实验重复4次。

1.10 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件分析,实验资料均以均数±标准差表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用独立样本t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表达情况

qPCR检测结果显示,乳腺癌患者血清中miR-7156-3p的表达水平为1.48±0.49,低于健康体检者(8.71±1.69),差异有统计学意义(P<0.01,见图1)。

与健康体检者相比,* * P <0.01图1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表达水平Figure 1 The expression level of miR-7156-3p in the serum of breast cancer patients

2.2 乳腺癌细胞株和人正常乳腺上皮细胞miR-7156-3p表达水平

qPCR检测结果显示,与正常乳腺上皮细胞MCF10A比较,乳腺癌细胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549中miR-7156-3p的表达明显降低(P<0.05),HCC1937细胞中的变化最为明显(P<0.01,见图2)。

与MCF10A细胞相比,* P <0.05,* * P <0.01图2 乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞中miR-7156-3p的表达水平Figure 2 The miR-7156-3p expression in breast cancer cell lines and normal breast epithelial cells

2.3 miR-7156-3p转染效率验证及各组HCC1937细胞中RAB1A mRNA的表达

miR-NC组和miR-7156-3p组HCC1937细胞中miR-7156-3p相对表达量分别为1.01±0.07和9.03±1.08,与miR-NC组相比,miR-7156-3p组HCC1937细胞中miR-7156-3p的表达显著增加(P<0.01)。miR-NC组和miR-7156-3p组HCC1937细胞中RAB1A mRNA相对表达量分别为1.01±0.08和0.25±0.05,与miR-NC组相比,miR-7156-3p组HCC1937细胞中RAB1A mRNA的表达明显降低(P<0.01)。

2.4 过表达miR-7156-3p对HCC1937细胞增殖能力的影响

MTT检测结果显示,与miR-NC组相比,从2 d开始,miR-7156-3p组HCC1937细胞的增殖能力显著下降(P<0.05,见图3)。

2.5 过表达miR-7156-3p对HCC1937细胞迁移的影响

Transwell小室实验检测结果显示,miR-NC组和miR-7156-3p组HCC1937细胞的迁移细胞数分别为147.80±16.30和58.87±12.14。与miR-NC组相比,过表达miR-7156-3p的HCC1937细胞迁移能力明显下降(P<0.01,见图4)。

与miR-NC组相比,* P <0.05,* * P <0.01图3 过表达miR-7156-3p对HCC1937细胞增殖的影响Figure 3 Effect of miR-7156-3p overexpression on proliferation of HCC1937 cells

图4 Transwell法检测过表达miR-7156-3p对HCC1937细胞迁移的影响 (结晶紫染色,×100)Figure 4 Effect of miR-7156-3p overexpression on migration of HCC1937 cells by Transwell (crystal violet staining,×100)

2.6 miR-7156-3p与靶基因结合位点验证

MicroT-CDS预测网站显示,miR-7156-3p可能的靶基因是RAB1A(见图5)。OncoLnc预后分析网站显示,RAB1A表达水平较低的乳腺癌患者生存期较长(P<0.05,见图6)。双荧光素酶报告基因检测系统显示,相比miR-NC,miR-7156-3p可明显下调RAB1A-WT质粒的报告荧光强度(P<0.01,见图7);对预测结合部位行突变处理后,相比miR-NC,miR-7156-3p不能抑制RAB1A-MUT质粒的报告荧光强度(P>0.05,见图7),表明miR-7156-3p的靶基因是RAB1A。

2.7 过表达miR-7156-3p对RAB1A蛋白及下游蛋白表达的影响

图5 miR-7156-3p与RAB1A-WT和RAB1A-MUT结合预测图Figure 5 The predicted map of miR-7156-3p binding to RAB1A-WT and RAB1A-MUT

Western blotting结果显示,与miR-NC组相比,转染miR-7156-3p后,RAB1A蛋白表达明显降低,AKT蛋白的磷酸化程度明显降低,AKT下游蛋白mTOR的表达明显降低(见图8)。

图6 RAB1A表达水平与乳腺癌患者生存期的关系Figure 6 Relationship between the expression level of RAB1A and the survival time of breast cancer patients

与miR-NC相比,* * P <0.01图7 双荧光素酶报告基因系统验证miR-7156-3p与RAB1A之间的靶向结合Figure 7 The dual luciferase reporter system verified the targeted binding between miR-7156-3p and RAB1A

与miR-NC组相比,* P <0.05,* * P <0.01图8 Western blotting检测miR-7156-3p对RAB1A蛋白及下游蛋白表达的影响Figure 8 Effect of miR-7156-3p on the expression of RAB1A protein and downstream proteins by Western blotting

3 讨论

miRNA在乳腺癌的发生、发展过程中具有重要调控作用[9,10]。近年来,越来越多的miRNA被发现在乳腺癌中异常表达,负责调控乳腺癌细胞的各种恶性生物学行为[11,12]。Huang等[13]报道,miR-532-5p在乳腺癌组织中高表达,下调miR-532-5p表达可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。Maimaitiming等[14]报道,与邻近癌旁组织相比,乳腺癌组织样品中miR-152的表达明显下调;过表达miR-152显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,ROCK1是miR-152在乳腺癌中的靶基因。有报道指出[8],神经胶质瘤组织中miR-7156-3p的表达显著下调,miR-7156-3p下降水平与神经胶质瘤患者的生存率密切相关,抑制miR-7156-3p表达可有效刺激神经胶质瘤细胞的转移和生长,增强miR-7156-3p表达可抑制神经胶质瘤细胞的转移和生长。本研究筛选出miR-7156-3p低表达最显著的HCC1937细胞进行实验,通过转染miR-7156-3p成功上调miR-7156-3p的表达后,HCC1937细胞的增殖和迁移能力明显降低,表明miR-7156-3p在乳腺癌的发生和发展过程中发挥抑癌基因的作用。

通过生物信息学方法预测显示,miR-7156-3p与Ras相关蛋白Rab-1A(Ras-related protein Rab-1A,RAB1A) mRNA的3′非翻译区存在结合位点,RAB1A可能是其靶基因。RAB1A蛋白属于Rab蛋白家族成员,参与调控细胞内的信号通路转导,影响细胞囊泡运输和膜转运等过程[15,16]。有报道显示,RAB1A在结直肠癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等恶性肿瘤中异常高表达,与肿瘤的大小、淋巴结转移和分期正相关[17,18]。RAB1A在乳腺癌组织中高表达,抑制RAB1A表达可降低乳腺癌细胞的增殖和转移能力[19]。本研究通过OncoLnc预后分析显示,RAB1A表达水平较低的乳腺癌患者生存期较长。通过双荧光素酶报告基因检测系统证实,RAB1A是miR-7156-3p的靶基因。qPCR和Western blotting检测结果进一步证实miR-7156-3p可负向调控RAB1A的表达。RAB1A主要通过促进AKT蛋白的磷酸化发挥癌基因作用[20]。Western blotting检测结果显示,miR-7156-3p降低RAB1A表达后,AKT蛋白的磷酸化程度明显降低,其下游蛋白mTOR的表达明显降低。

综上所述,miR-7156-3p在乳腺癌患者血清及乳腺癌细胞株中低表达,过表达miR-7156-3p可通过靶向调控RAB1A基因的表达,降低AKT蛋白的磷酸化,抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。本研究为miR-7156-3p作为乳腺癌诊断和治疗的分子标志物和治疗靶点提供了一定的实验基础。