HPLC法同时测定山西不同区域黄芩叶中3种黄酮类成分含量

乔丽芳,王喜明,杨莹莹,高文军,李卫红

(山西省医药与生命科学研究院分析仪器室,太原 030006;*通讯作者,E-mail:lwh191@soho.com)

黄芩叶为唇形科植物黄芩属(ScutellariabaicalensisGeorgi)多年生草本植物黄芩的干燥叶。黄芩叶中黄酮类成分具有较强的抗氧化、抗炎、解热、镇痛、抗肿瘤、降压、降血脂、扩张血管、增加脑和冠脉血流量等多种药理活性,并且有提高机体免疫力等活性和高效低毒的特点,对顽固性失眠亦有明显的改善作用[1]。国内外学者通过实验研究,充分肯定了黄芩叶的药用价值[2,3]。现代研究证实黄芩茎叶中主要含有黄酮类、有机酸类、二萜类、挥发油类、多糖类等资源性化学成分[4,5]。黄芩传统药用其根,茎叶一向被废弃。山西是黄芩主产地之一,在全省各种中药材中分布面积最广,应充分利用被废弃的黄芩叶资源,加强黄芩全草资源的可持续利用,有效提高黄芩叶的经济利用价值[6,7]。

本实验基于文献[8-10],收集了36批次来自山西不同区域的黄芩叶样品,并采用HPLC法同时测定36批次来自山西不同区域的黄芩叶3种黄酮类成分的含量并评价不同区域黄芩叶之间的异同,为非传统药用部位黄芩叶的资源循环利用提供理论基础与科学依据。

1 仪器与材料

Waters ARC型高效液相色谱仪(四元泵,PDA检测器,自动进样器,Empower 3化学工作站);岛津分析天平(AUW220D,日本岛津);中草药粉碎机(FW-135天津市泰斯特仪器有限公司);超纯水系统(HHitech和泰);超声波多频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

野黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110842-201709,纯度91.7%),芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:PRF9121944,纯度98%),白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:PRF9110703),甲醇和乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯,水为自制超纯水。

供试材料为采自山西省36个产地的黄芩叶(见表1)。

表1 样品来源及编号

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 取野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 ml含野黄芩苷1.958 mg的储备液25 ml、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷1.004 mg储备液25 ml、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷1.137 mg的储备液25 ml,4 ℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 采摘的黄芩叶在阴凉处晾干,粉粹,备用。取其粉末(过4号筛)约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇20 ml,称定质量,密塞,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)40 min,放冷至室温,再称定质量,用60%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,制得供试品溶液。

2.2 色谱条件

Ameritech C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-甲醇-0.1%甲酸水溶液线性梯度洗脱(见表2);流速:1 ml/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μl;检测波长:278 nm。

表2 梯度洗脱条件

2.3 专属性考察

分别吸取上述各对照品溶液适量,混合,制得混合对照品溶液,分别吸取上述供试品溶液、混合对照品溶液以及甲醇空白溶液各10 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,见图1。

1.野黄芩苷(scutellarin);2.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranside);3.白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(chrysin-7-O-β-D-glucuronide)图1 混合对照品、供试品、空白样品的色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances,sample,blank sample

由图1可知,在野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品色谱峰相应的位置上,供试品色谱图中显示相同保留时间的色谱峰,空白溶液无干扰。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述各对照品溶液适量,置于5 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,制得每1 ml含野黄芩苷391.6 μg、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷120.5 μg、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷56.84 μg的混合对照品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液0.5,1,5,10,15,20 μl,注入液相色谱仪,测定,记录色谱图。以待测成分含量(x,μg)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标进行线性回归,测定结果见表3。

从表3可以看出,野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷分别在含量为0.195 8-7.831 μg,0.060 27-2.411 μg和0.028 42-1.137 μg的范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度考察

取供试品溶液10 μl,注入液相色谱仪,重复连续进样6次,记录色谱图。结果表明,野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面积的RSD分别为0.15%,0.08%,0.11%,仪器精密度良好(见表4)。

2.6 重复性考察

精密称取同一批样品(绛县南樊镇药物培植场7号)适量,制得供试品溶液,共6份,分别取样10 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,并计算含量。结果表明,野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷的平均含量分别为3.30%,1.11%,0.10%,RSD分别为1.16%,0.92%,2.47%(见表4),表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

取供试品(绛县南樊镇药物培植场7号)溶液一份,分别于0,6,12,18,24,48 h时取样10 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。结果表明,野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面积的RSD分别为0.35%,0.97%,2.81%(见表4),表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

表3 三种成分的回归方程、相关系数、线性范围和检测限

表4 三种成分的精密度、重复性、稳定性 (%,n=6)

2.8 加样回收率考察

取供试品(绛县南樊镇药物培植场7号)约0.1 g,精密称定,共6份,分别加入一定含量的野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品,按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,按测定方法进行测定,计算样品含量,并计算加样回收率,结果见表5。

表5 三种成分的加样回收率

结果表明,3种检测指标的加样回收率和相对标准差均符合要求,表明本方法具有良好的检测性能。

2.9 样品含量测定

取不同产地的供试样品,按供试品溶液制备方法,制得供试品溶液,按测定方法进行测定,记录色谱图,计算得各样品含量。结果见表6。

由表6可得出,在山西境内不同区域的黄芩叶中三种黄酮类成分的含量,野黄芩苷>芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷>白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷,野黄芩苷的含量集中在2.11%-3.43%之间,芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量集中在0.61%-2.03%之间,白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量集中在0.01%-0.73%之间。

3 提取条件的选择和色谱分析测定条件的选择

3.1 提取溶剂浓度的考察

本研究分别考察了60%,70%浓度的乙醇对3种成分提取率的影响。发现60%乙醇对野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷的提取率高些,所以选择60%乙醇作为提取溶剂。

3.2 提取时间的选择

考察不同超声提取时间(10,20,30,40,50 min)对提取率的影响时,发现随着超声时间的延长,提取率逐渐增高,但是超过40 min后,提取率差别不大。考虑到时间成本和能耗,我们选择超声提取时间为40 min。

3.3 提取次数考察

考察了不同提取次数(1次和2次),发现第1次已基本提取完全,第2次只有少量残留,所以选择一次提取。

3.4 检测波长的选择

本实验对色谱条件的检测波长进行了选择,通过对野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷混合对照品溶液的全波长扫描,发现野黄芩苷最大吸收波长为334 nm,芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷最大吸收波长为336 nm,白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷最大吸收波长为267 nm,结合3D图谱以及各波长时3个峰面积的变化程度,最终选择了278 nm为本次实验的检测波长。

表6 样品中3个成分的含量测定结果

3.5 色谱系统的选择

本实验分别对流动相甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水系统进行了考察,比较了分离度、峰形、分析时间等因素后,选择了甲醇-乙腈-水系统。

3.6 柱温的选择

通过比较25,30,35,40 ℃柱温,30 ℃时分离度,峰形相对较好。

3.7 流动相种类及浓度的选择

考察了乙腈-甲酸水,甲醇-甲酸水,甲醇-乙腈-甲酸水三种流动相系统,发现甲醇-乙腈-0.1%甲酸水可以满足本实验的需求,故流动相选择为甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液。

4 结论

山西作为黄芩药材的主产地之一,有着较大的栽培面积以及栽培历史,每年的黄芩叶产量十分巨大,大部分未能被有效地利用起来。本研究首次建立了HPLC法同时测定山西境内黄芩叶中3种黄酮类成分的方法,该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性及回收率,表明检测方法可行。应用所建立的方法测定不同区域黄芩叶中的3种成分的含量,其中野黄芩苷的含量最高。这为黄芩叶资源的利用提供了翔实的科学依据,为山西黄芩资源的进一步开发提供了理论基础。