miR-144t通过对肝细胞生长因子的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移及延缓肝癌进展

樊赟 樊纪民 卞华

(1南阳理工学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473000;2河南省南阳市卧龙区中医药管理局)

肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌(PLC)的病理类型之一，占比达90%以上，肝癌发病率居世界癌症发病率第五位，致死率居第二位〔1〕，我国肝细胞癌发病率占世界总数的55%〔2〕，且发病率逐年增加。近年，肿瘤分子靶向治疗成为肝癌治疗的热点，临床上细胞分子靶向治疗对于肝癌，尤其是晚期阶段发挥重要作用〔3〕。肝细胞生长因子(HGF)由肝脏间叶细胞分泌，可调控多种组织及细胞增殖分化，如启动肝再生、促细胞分裂、运动、抗凋亡等〔4〕。HGF主要通过与c-met形成二聚体，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)等通路，发挥其生物学功能〔5〕。miRNA是一种单链非编码小分子RNA，它可调控人类基因组中约三分之一基因的表达，研究表明，近一半已知miRNAs与肿瘤相关，发挥致癌或抑癌作用〔6〕。本研通过分析miR-144对靶基因HGF调控作用，为诊断及治疗肝癌提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1组织样本采集 收集2016年12月至2018年5月就诊于南阳理工学院附属医院病理科确诊为肝癌的患者69例，其中男51例，女18例，平均年龄(55.29±8.41)岁。采集肝癌组织及匹配癌旁组织，肝癌组织均由病理学医师共同诊断，且取样前未行放化疗。

1.2方法

1.2.1标本采集 清晨空腹采集肝癌患者外周静脉血3 ml，1 000 r/min离心10 min，采集血清，-80℃保存待测。

1.2.2qRT-PCR检测miR-144表达量 取0.5 ml血清标本，采用Trizol法提取血清总RNA，进行RNA逆转录，合成cDNA，进行PCR反应。实验步骤均按照试剂盒中说明书进行。

1.2.3细胞培养和转染 肝癌细胞SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2及人肝上皮细胞THLE-3均购自上海中科院细胞库。测定及比较上述细胞中miR-144表达量、HGF mRNA及蛋白表达。选取MHCC97H细胞进行后续实验。DMEM培养基(37℃，5%CO2)培养MHCC97H细胞，分为miR-NC组、miR-144组、miR-144+HGF组，分别转染阴性对照miRNA模拟物(mimics)、miR-144 mimics、miR-144 mimics+HGF，均根据LipofectamineTM2000的转染试剂说明进行转染。

1.2.4荧光素酶检测实验 经miRNA靶基因数据库，预测出miR-144与HGF的可能结合位点。构建HGF野生型3′-UTR荧光素酶质粒pMIR-WT和突变型质粒pMIR-Mut。将MHCC97H细胞进行分组，分别转染野生型质粒pMIR-WT、突变型质粒pMIR-Mut与miR-144 mimics和阴性对照miRNA mimics。检测各组荧光素酶活性。

1.2.5Western印迹检测 经分离凝胶蛋白电泳(电压120 V)与浓缩胶蛋白电泳(电压80 V)进行蛋白分离，之后进行转膜，TBST室温下封闭1 h，加入HGF抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶1 000)，GAPDH为内参，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，电化学发光(ECL)试剂盒(Millipore公司)显影，凝胶成像系统扫描，Get Image System软件进行分析。

1.2.6CCK8检测 将miR-NC组、 miR- 144组及miR-144+HGF组细胞转染24 h后，接种于96孔培养板，每孔加10 ml CCK8，详细步骤按照试剂盒说明书步骤进行，480 nm波长处测定OD值。

1.2.7细胞划痕实验检测 将miR-NC 组、 miR- 144组及miR-144+HGF组细胞经胰酶消化，吹打为单细胞悬液，24 h待细胞长成单层弃去培养液，在孔中央进行划痕，显微镜下拍照，测量并计算24 h细胞迁移距离。

1.2.8流式细胞法检测 取miR-NC组、miR-144组、miR-144+HGF组细胞通过胰蛋白酶消化后，吹打成单细胞悬液，以2×104个/ml浓度接种于24孔培养板中。培养液培养，细胞贴壁后加入50 ng/ml的HGF。待消化后收集细胞，并通过离心弃除上清液，以PBS洗涤2次，缓冲液悬浮细胞，加入膜联蛋白V，混匀，再加入核酸荧光染料碘化丙啶，混匀后避光反应，流式细胞仪检测。

1.2.9构建肝癌裸鼠模型 8只裸鼠，75%酒精常规消毒后肢，4号注射针经皮穿刺，将阴性对照miRNA mimics (miR-NC组)，miR-144 mimics转染(miR-144组)进MHCC97H细胞并注射到裸鼠皮下(0.2 ml，约含细胞2×107个)，正常饲养，每日给药1次，隔日称重，10 d后眼球取血，以颈椎脱臼法将其处死，剥取肿瘤组织，置甲醛固定。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1肝癌患者细胞中miR-144的表达量 肝癌组织中miR-144表达量明显低于癌旁正常组织〔(0.28±0.09)vs(1.00±0.21)〕，差异具有统计学意义(t=5.458，P=0.005)。miR-144在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中的表达量分别为(1.00±0.21)、(0.71±0.17)、(0.34±0.03)、(0.52±0.06)和(0.58±0.13)，组间比较差异有统计学意义(F=9.613，P=0.002)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中miR-144的表达量均明显低于THLE-3，差异均有统计学意义(t=16.335，22.412，18.211，17.336；P均<0.001)。

2.2miR-144通过结合HGF的3′-UTR来抑制HGF的表达 miRNA靶基因数据库预测结果显示，HGF为miR-144潜在靶基因(图1)。双荧光素酶活性检测结果显示，对于WT-HGF野生型报告基因质粒，miR-144组的荧光素酶活性明显低于miR-NC组〔(17.61±1.12)vs(33.42±1.37),t=15.47，P=0.001〕。对于Mut-HGF突变型报告基因质粒，两组荧光素酶活性无显著差异〔(35.32±3.42) vs (33.42±3.31);t=0.691,P=0.527〕。

miR-144组HGF mRNA表达水平明显低于miR-NC组〔(0.39±0.05)vs(1.0±0.21)，t=4.894，P=0.0081<0.01〕。Western印迹检测结果显示，miR-144组HGF蛋白表达水平较miR-NC组明显降低，差异有统计学意义〔(0.34±0.13)vs(1.0±0.21)，t=4.628，P<0.01〕。见图2。上述结果说明，miR-144能够抑制HGF mRNA及蛋白表达。

图1 HGF为miR-144的潜在靶基因

图2 Western印迹法检测HGF蛋白表达

2.3HGF在肝癌组织及细胞中mRNA及蛋白的表达 HGF在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中mRNA的表达量分别为(1.0±0.17)、(1.27±0.21)、(1.54±0.26)、(1.47±0.16)和(1.86±0.27)，组间比较差异有统计学意义(F=6.416，P=0.008)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中HGF mRNA的表达量均明显高于THLE-3(t=17.554，22.478，25.231，28.406；P均<0.001)。

肝癌肿瘤组织中HGF mRNA表达量明显高于癌旁正常组织〔(2.32±0.41)vs(1.0±0.23)，t=23.32，P<0.01〕。

免疫组化实验结果显示，肿瘤组织中、癌旁正常组织中HGF阳性染色细胞数分别为(125.50±16.66)个/HP、(37.42±3.58)个/HP，HGF在肿瘤组织中的表达量明显高于癌旁正常组织(t=42.936，P<0.001)，见图3。以上结果表明，HGF可促进肝癌的发展，而miR-144通过抑制HGF的表达参与肝癌的进展。

图3 HGF在肝癌组织及癌旁正常组织中的表达(IHC，×25)

2.4miR-144和HGF与细胞增殖，迁移及周期的相关性 miR-NC组、miR-144组、miR-144+HGF组的OD值分别为(0.69±0.15)、(0.58±0.12)、(1.34±0.19)。miR-144组的OD值低于miR-NC组，但差异无统计学意义(t=0.992，P=0.377)。miR-144+HGF组的OD值明显高于miR-144组，差异有统计学意义(t=5.858，P=0.004)。

流式细胞法检测发现，miR-144组S期细胞比值〔(14.46±2.33)%〕低于miR-NC组〔(19.11±3.05)%〕，但差异无统计学意义(t=2.098，P=0.104)。而miR-144+HGF组S期细胞比值〔(24.54±2.66)%〕明显高于miR-144组，差异有统计学意义(t=4.937，P=0.008)。

细胞划痕实验结果显示，12 h后miR-NC组、miR-144组、miR-144+HGF组的细胞迁移个数分别为(185.62±22.33)个、(35.42±6.66)个、(210.33±19.56)个。miR-144组细胞迁移细胞数明显低于miR-NC组，差异有统计学意义(t=11.164，P<0.001)。miR-144+HGF组细胞迁移数明显高于miR-144组，差异有统计学意义(t=14.662，P<0.001)。见图4。以上结果表明，miR-144可抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖，迁移和细胞周期在S期聚集，而这些抑制效果可被HGF补回。

图4 各组细胞迁移实验(×40)

2.5miR-144抑制裸鼠皮下肿瘤进程 miR-144组肿瘤组织重量明显低于miR-NC组〔(0.14±0.06) vs (0.52±0.11)g〕，差异有统计学意义(t=7.429，P<0.001)。miR-144在miR-144组中的表达量明显高于miR-NC组〔(7.56±1.02) vs (1.0±0.12)〕，差异有统计学意义(t=15.65，P<0.001)。HGF在miR-144组中的表达量明显低于miR-NC组〔(0.38±0.05) vs (1.0±0.13)〕，差异有统计学意义(t=10.922，P<0.001)。

Ki67染色结果显示，miR-NC组、miR-144组的Ki67阳性染色细胞数分别为(69.35±10.32)个/HP、(16.99±3.47)个/HP，miR-144组的Ki67阳性染色细胞数明显低于miR-NC组，差异有统计学意义(t=13.602，P<0.001)。见图5。

HE染色结果显示，miR-NC组、miR-144组的阳性染色细胞数分别为(112.49±15.02)个/HP、(52.33±6.32)个/HP，miR-144组的阳性染色细胞数明显低于miR-NC组，差异有统计学意义(t=10.442，P<0.001)。见图5。以上结果说明miR-144能够抑制HGF表达并抑制肝癌细胞的增殖。

图5 miR-144抑制裸鼠皮下肿瘤进程(×40)

3 讨 论

目前研究示HCC、肝内胆管癌及混合性肝癌等为PLC主要病理类型，其中HCC占比达90%以上〔7〕。肝癌在发展中国家的发病率远高于发达国家，我国则是其发病率及死亡率较高的国家之一〔8〕。

miRNA在人类基因表达及肿瘤发生中发挥着重要作用，其中miR-144在多种肿瘤中均发挥抑制作用。研究表明，在肺癌中，miR-144可通过控制凋亡调节因子的表达影响肿瘤细胞的增殖和凋亡〔9〕；在肝癌中，通过对肝癌组织和细胞中检测发现，miR-144可通过调节转录因子(E2F)3的表达，对肝癌细胞的生长产生影响〔10〕。本研究结果证实，miR-144在肿瘤组织比癌旁正常组织中的表达量降低，并且在构建肝癌皮下种植裸鼠模型中，也发现miR-144在肝癌内表达量显著降低。这表明miR-144对肝癌有相关调控作用。

HGF具有多种生物学功能，常通过自分泌或旁分泌的形式作用于包括肿瘤细胞在内的多种上皮细胞，能刺激肝细胞DNA的合成，促进肝再生，同时还能促进肝癌细胞增殖、运动及血管形成〔11〕。尤其在肝癌切除术后，HGF分泌活跃，诱导特异性跨膜受体c-Met过量表达，促使了肝癌复发，因此抑制HGF/c-met信号传导通路对减少肝癌复发及转移发挥着重要作用〔12〕。研究发现，HGF可以激活Bcl-2基因表达、下调Bax蛋白活性，发挥抗细胞凋亡的作用〔13〕。HGF还可通过刺激血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-1及c-Met在血管内皮细胞中的表达，促进肿瘤新生血管形成。HGF/c-Met信号转导通路在人体内正常细胞向恶性细胞转化过程中发挥重要作用〔14,15〕。在致癌性转化过程中Met活性调节可能与正常的c-Met活性调节完全不同。研究发现，Met基因缺失的小鼠表现为因肝脏和胎盘发育严重缺陷导致胚胎致死，其特点与小鼠HGF基因缺失表现十分相似。HGF/c-Met信号通路可以在多个胚胎组织中调节形态发生和浸润性生长〔16〕。本研究结果说明miR-144能够抑制HGF的表达量并抑制肝癌细胞的增殖，这预示miR-144能够通过抑制HGF的表达，从而抑制肝癌的发展。

综上所述，miR-144可抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖，迁移和细胞周期在S期聚集，而这些抑制效果可被HGF补回，而miR-144能够抑制HGF的表达并抑制肝癌细胞的增殖，对肝癌有抑制效果。