NrF2/Keap1/ARE信号通路在老年性青光眼患者小梁网组织功能损伤中的作用

王晓莉 张键 王友 李艳 龚雪 唐静

(1简阳市人民医院眼科，四川 简阳 641400；2四川大学华西医院眼科)

老年性青光眼是一种视功能障碍性疾病，以眼压升高所致的视乳头低灌注为主要病理特征，临床表现为视功能受损、视神经受压等症状，小梁组织变异在其中发挥重要作用〔1〕。房水主要经小梁网流出，但小梁组织功能异常时会阻碍房水正常流出，使眼压升高〔2〕。近年来研究显示，氧化应激和线粒体功能受损是小梁网细胞功能异常的主要原因之一，但具体分子机制仍未阐明〔3〕。E2 相关因子(NrF)2是调节细胞内多种抗氧化物质活性水平的主要因子，能够维持细胞的氧化-抗氧化平衡〔4〕。NrF2/ Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1/抗氧化反应元件(ARE)作为抗氧化应激信号通路已得到广泛认可，与多种眼科疾病的发生与发展密切相关〔5〕。本研究旨在探讨NrF2/Keap1/ARE信号通路在老年性青光眼患者小梁网组织功能损伤中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年5月至2019年10月在简阳市人民医院确诊为老年性青光眼患者42例(42眼)为老年性青光眼组。入选标准：①符合中国原发性青光眼诊治专家共识中对老年性青光眼的相关诊断标准；②视力、色觉等视功能障碍，签署知情同意书。排除标准：①虹膜炎、睫状体炎等眼病所致的眼压升高；②有眼部手术史或临床资料不完整者。其中男24例，女18例；年龄62～81岁，平均(71.53±5.28)岁。另以因故死亡成人的供体眼球标本35例为对照组。其中男21例，女14例；年龄57～76岁，平均(69.95±4.75)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2标本与主要试剂 老年性青光眼患者均行小梁切除术，将术中切除的小梁网组织标本分为两部分，一分部液氮处理后-80℃保存；另一部分使用多聚甲醛固定后4℃冷藏保存。对照组切取小梁组织，标本处理方法同老年性青光眼组。免疫组化检测试剂盒、Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒购于广州国奥生物有限公司；全蛋白提取试剂盒购于上海百研生物有限公司；兔抗人NrF2、ARE多克隆抗体、鼠抗人Keap1单克隆抗体、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均购于江苏恩莫阿赛生物有限公司；过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性检测试剂盒均购于山东苏柯汉生物工程有限公司。

1.3免疫组化染色 取多聚甲醛固定的小梁网组织，石蜡包埋后连续切片，厚度4 μm，加入二甲苯和乙醇溶液，脱蜡至水，修复液中高压修复抗原，室温冷却后磷酸盐缓冲液冲洗。3%H2O2孵育15 min，分别加入一抗(1∶500稀释)，37℃孵育2 h，磷酸盐缓冲液冲洗，加入二抗，室温孵育20 min，磷酸盐缓冲液冲洗。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。梯度乙醇溶液逐级脱水，透明，中性树脂封片。以磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照，阳性染色呈棕黄色，光学显微镜下计数NrF2、Keap1、ARE阳性表达率。

1.4RT-PCR检测 取-80℃保存的小梁网组织标本，Trizol法提取总RNA，测定纯度和浓度，逆转录得到cDNA。NrF2、Keap1、ARE及内参GAPDH引物由上海百研生物有限公司设计合成，NrF2引物序列：上游5'-GGGATATCACTCAGCATAAT-3'，下游5'-GGCGACTCGTTATTGATCGT-3'；Keap1引物序列：上游5'-CAATACTACAGCGTCGAAAATCT-3'，下游5'-GAGGTGGCATGTGCGGATGCTAT-3'；ARE引物序列：上游5'-TGACTAGTATTAGTCGGTAT-3'，下游5'-GTAGAGGTGAGTCGTCCGACC-3'；内参GAPDH引物序列：上游5'-GCAATGCGATTGATCCCGTAC-3'，下游5'-CAGCACTGACCCTTTGGTACT-3'。反应条件：94℃ 3 min，94℃ 50 s，50～65℃ 40 s，共35个循环，延伸72℃ 5 min。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算NrF2、Keap1、ARE mRNA的相对表达量。

1.5Western印迹检测 取-80℃保存的小梁网组织标本，全蛋白提取试剂盒提取标本组织总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。取目标蛋白加入适量缓冲液，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后分别滴加兔抗人NrF2多克隆抗体(1∶500)、ARE多克隆抗体(1∶300)，鼠抗人Keap1单克隆抗体(1∶500)、GAPDH多克隆抗体(1∶1 000)，4℃冷藏过夜，次日滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，山羊抗鼠IgG，均为1∶2 000稀释，室温孵育2 h，电化学(ECL)显色，暗室中显影、采集图像，分析各条带灰度值。

1.6小梁网组织中过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平检测 取-80℃保存的小梁网组织标本，组织匀浆，4℃ 12 000 r/min恒温离心10 min，收集上清液，比色法检测过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平，检测过程严格按试剂盒说明书进行。

1.7统计学分析 使用SPSS22.0软件进行t检验、χ2检验及Pearson相关分析。

2 结 果

2.1免疫组化检测小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE表达情况 免疫组化染色显示，Keap1在老年性青光眼患者小梁网组织中存在大量阳性表达，而NrF2、ARE阳性表达不明显。NrF2主要表达于细胞质，Keap1、ARE主要表达于细胞质和细胞核。老年性青光眼组NrF2、ARE阳性表达率显著低于对照组，Keap1阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)。见图1，表1。

图1 免疫组化检两组测两组小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE表达(SP法，×200)

表1 两组小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE阳性表达率比较

2.2两组小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表达比较 老年性青光眼组小梁网组织中NrF2、ARE mRNA表达显著低于对照组，Keap1 mRNA表达显著高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；老年性青光眼组小梁网组织中NrF2、ARE蛋白表达显著低于对照组，Keap1蛋白表达显著高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表2，图2。

表2 两组NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白相对表达量比较

图2 小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE蛋白Western印迹电泳

2.3两组小梁网组织中过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比较 老年性青光眼组小梁网组织中过氧化物酶水平显著高于对照组，超氧化物歧化酶水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表3。

表3 两组小梁网组织中过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比较

2.4老年性青光眼组小梁网组织中NrF2、Keap1、ARE表达与过氧化物酶和超氧化物歧化酶的相关性 NrF2、ARE与过氧化物酶水平呈负相关(r=-0.718、-0.763，P=0.003、0.000)，与超氧化物歧化酶水平呈正相关(r=0.750、0.795，均P=0.000)。Keap1与过氧化物酶水平呈正相关(r=0.811，P=0.000)，与超氧化物歧化酶水平呈负相关(r=-0.849，P=0.000)。

3 讨 论

老年性青光眼以视野障碍和视盘受损为主要特征。相关研究显示，眼压≥20 mmHg患者老年性青光眼的发生风险约为眼压<20 mmHg患者的16倍，提示高眼压是老年性青光眼的主要病理因素〔6〕。小梁网位于前房角的角巩膜边缘区域，呈三角形，能够调节房水流出〔7〕；研究者在小梁网胞外基质中观察到了大量基因突变，硬度增加，提示小梁网内皮细胞增加、组织硬化等是老年性青光眼患者眼压升高的主要原因，眼压升高会进一步压缩小梁网，造成细胞外基质沉积，房水流出阻力增加〔8〕。因此，探讨小梁网组织病变的相关机制对提升老年性青光眼的降眼压治疗效果具有重要意义。

转录因子NrF2在亮氨酸调节蛋白家族成员中活性最强，广泛表达于人体各器官和组织细胞中〔9〕。NrF2包括NeH1～6个不同的功能区域，其中NeH1为含C末端的结构域，参与NrF2识别并结合抗氧化活性因子ARE；NeH2与Keap1结合后能够抑制NrF2活化，使NrF2处于失活状态；NeH3是NrF2的转录激活区域，与重组蛋白结合后能够上调NrF2靶基因的表达；NeH4和NeH5同时与辅助因子CBP结合后，能够启动NrF2下游基因转录；NeH6是氧化还原反应的不敏感区，能够降解氧化激活的NrF2〔10，11〕。综合上述各功能区域的作用，NrF2高表达能够促进机体的抗氧化作用，降低机体的氧化应激反应。Keap1是NrF2的多区域抑制蛋白，由CTR、NTR、DGR在内的5个结构域组成〔12〕。Keap1能够通过DGR区域与NrF2特异性结合，分布于肌动蛋白细胞骨架上，抑制NrF2进入细胞核，进而抑制其活性〔13〕。同时CTR、NTR能够参与泛素连接酶的合成，参与NrF2降解，与NrF2稳定性有关〔14〕。因此，Keap1表达上调会降低NrF2活性和稳定性，增强体内的氧化应激反应。抗氧化反应元件ARE是人体重要的保护性应答元件，序列位于编码保护蛋白基因上游的启动子区，激活后可上调NADH氧化还原酶复合物、谷胱甘肽转移酶等多种保护性基因的表达〔15〕。

本研究结果提示老年性青光眼患者小梁网组织中NrF2、ARE低表达，Keap1高表达。目前关于NrF2/Keap1/ARE信号通路激活机制的研究显示，NrF2介导细胞防御的开启和关闭主要与Keap1的负性调节有关〔16〕。人体正常状态下，NrF2主要分布于细胞质，与抑制蛋白Keap1处于动态平衡状态，维持机体的氧化应激平衡〔17〕。当受到抗氧化剂或亲电子物质作用时，Keap1上的氨基酸残基被修饰，构象发生改变，与NrF2的耦联作用减弱，NrF2活性增强，Keap1与NrF2之间的平衡状态被打破，机体氧化应激状态减弱〔18〕。同时NrF2还存在另一种磷酸化激活方式，当NrF2被磷酸化激活后会出现核内转位，通过植物碱性亮氨酸拉链结构与小Maf家族蛋白特异性结合形成活化ARE，减弱机体的氧化应激状态〔19〕。

线粒体分泌的活性氧是人体氧化应激的主要促进因素，促氧化标志物过氧化物酶和抗氧化标志物超氧化物歧化酶可从多个途径损伤小梁网细胞DNA，导致小梁网细胞死亡〔20〕。本研究结果提示NrF2、ARE高表达能够有效降低老年性青光眼患者小梁网组织中的促氧化活性物质分泌水平，提升抗氧化活性物质的分泌水平，抑制氧化应激状态，进而降低眼压，实现控制和改善临床症状的目的。

综上，老年性青光眼患者小梁网组织中NrF2、ARE低表达，Keap1高表达，与氧化应激状态有关。通过激活NrF2/Keap1/ARE信号通路可能改善小梁网组织线粒体功能，抑制氧化应激状态，降低眼内压，控制患者的临床症状。