血红素加氧酶对肝癌细胞CyclinE、p27的影响

高涵 吴琦 陈宏月 郭红艳 周涛 刘哲丞

(1齐齐哈尔医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2附属第一医院普通外科)

血红素加氧酶(HO)能催化血红素分解生成胆绿素，是血红素分解的限速酶。HO有3种亚型：HO-1、HO-2和HO-3，它们在基本结构、表达调节和组织分布中有很大差异。HO-1是Wise等〔1〕最先在体外实验中发现的一种能降解血红素的酶，命名为HO-1，HO-1可能与肿瘤的发生和发展有关。Llesuy等〔2〕研究发现这种酶可能具有细胞保护作用。

近年来研究发现，多种人类肿瘤有细胞周期蛋白(Cyclin)E基因的扩增和过度表达，可协同某些癌基因转化细胞和增强细胞的癌变倾向。Peng等〔3〕研究了CyclinD1和CyclinE异常表达及在肝癌中的作用，发现71例肝癌患者中有40例 CyclinE过度表达，且与低分化肝癌密切相关，提示CyclinE异常表达与肝癌生物学行为有关。p27是一个广谱细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子，它作为细胞周期的抑制剂，主要是通过与CDK或Cyclin-CDK复合物结合，抑制CDK的活性，从而对细胞周期进行调控。此外，p27能够促进细胞分化、抑制细胞增殖〔4〕。在以往的研究〔5,6〕中发现，肝癌组织中HO-1是高表达的。在前期实验中发现mtHO-1G143H转基因小鼠出现了多脏器肿瘤，此结果提示HO-1突变体的表达可能会影响细胞的增殖能力。本研究主要探讨HO-1对肝癌细胞CyclinE、p27的影响。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞系HepG2、质粒pcDNA3.1(+)和pCAAG由本实验室保存。胎牛血清、1640培养基购于美国GIBCO公司；限制性核酸内切酶Bam HⅠ/EcoRⅠ购于美国NEB公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司；小鼠抗HO-1抗体购于德国默克公司；兔抗β-actin抗体购于美国Santa Cruzs公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠二抗和HRP标记山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥公司。

1.2重组载体的构建 将构建的重组载体pCAAG-wtHO-1和pCAAG-mtHO-1-G143中的野生型HO-1(wt)和突变型HO-1(G143H)基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组质粒pcDNA3.1(+)wtHO-1、pcDNA3.1(+)mtHO-1G143H。插入片段大小为1 122 bp。

1.2.1引物设计与PCR扩增 扩增wtHO-1/mtHO-1G143H片段的引物序列：上游引物：5′-CCGGATCCTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3′ ，下游引物：5′-CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG-3′ ，上游下游引物分别引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点。扩增条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸45 s。30个循环后于72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。

1.2.2载体与目的片段连接 载体∶目的片段=1∶3,用T4连接酶16℃过夜转化。

1.2.3制备感受态细胞 用接种环取冻结的DH5α菌种在平板培养基上划线，37℃倒置培养12～16 h，挑取单菌落置10 ml LB培养基(不含氨苄青霉素)，120 r/min振荡过夜，次日取菌液1 ml接种到含有100 ml LB培养基(不含氨苄青霉素)的锥形瓶中，37℃ 170 r/min剧烈振摇培养2～3 h待OD值为0.3～0.4，取出后立即冰浴10～15 min，无菌条件下将细菌转移至灭菌的冰预冷的50 ml离心管中，4℃离心，4 000 r/min 10 min，弃去上清，将离心管倒置于滤纸上1 min，加入冰预冷的0.1 mol/L氮化钙(CaCl2) 10 ml重悬菌体，4℃，4 000 r/min离心10 min，弃上清，倒置于滤纸上1 min，每50 ml培养物加冰预冷的0.1 mol/L CaCl22 ml，每管200 μl分装+20%灭菌甘油，-80℃保存。

1.2.4细菌的转化 从-80℃冰箱中取出感受态细菌解冻，立即吸取20 μl转移至1.5 ml无菌EP管中，每管加质粒50～100 ng，其中包括阳性对照、阴性对照(无菌水)、目的质粒，轻轻旋转混合内容物，放置冰上30 min，42℃保温(热休克)60 s，置于冰上1～2 min，加入180 μl无抗生素LB培养基，37℃摇床120 r/min振摇45～90 min，将200 μl菌液铺于100 μg/ml含氨苄青霉素的琼脂平板，室温平放10 min，37℃倒置培养12～16 h，挑取单克隆将其放入LB培养液(含氨苄青霉素)中37℃摇床110 r/min震荡过夜。应用质粒提取试剂盒提取质粒，提取后酶切鉴定。选择T7测序引物，由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3HepG2细胞培养、转染及HO-1鉴定

1.3.1细胞培养 HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清、pH值为7.2～7.4的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中常规培养。

1.3.2细胞转染 HepG2细胞以5×104个/孔接种于24孔板，细胞融合至60%～70%时，加入含有不同浓度的G418培养液，14 d左右根据细胞死亡情况确定G418对HepG2细胞的最小致死剂量。

选取生长状态良好的对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，分为四组：空白对照组；pCDNA3.1(+)空质粒组；pCDNA3.1-wt HO-1转染组；pCDNA3.1-mtHO-1G143H转染组，进行脂质体介导HepG2细胞转染和筛选，建立稳定转染的细胞系。

1.3.3HO-1鉴定 选取稳定转染的HepG2细胞，采用RT-PCR检测转染细胞中外源性wtHO-1、mtHO-1G143H基因的mRNA表达水平。根据RT-PCR结果，选取在mRNA表达水平上过表达wtHO-1较多的5号克隆和mtHO-1G143H的7号克隆，转染空载体1号克隆，提取细胞总蛋白，进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以HO-1的特异性单克隆抗体进行免疫印迹。

1.4检测CyclinE、p27 mRNA水平的变化 提取总RNA，将提取细胞总RNA进行逆转录(RT)反应，聚合酶链反应(PCR)，β-actin作为内参照。CyclinE引物序列：上游引物：5′-CAGGGTATCAGTGGTGCGACA-3′，下游引物：5′-CTGCTTCTTACCGCTCTG-3′，扩增片段长度为232 bp。扩增条件为：94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环。p27引物序列：上游引物：5′-CCTGGAGCGGATGGAC-3′，下游引物：5′-CCTCTTGCCACTCGTACTTGC-3′，扩增片段长度为240 bp。扩增条件为：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1重组载体的鉴定 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H质粒经双酶切、经琼脂糖凝胶电泳，见图1，产物符合pcDNA3.1(+)线性片段(5 400 bp)和目的基因wtHO-1/mtHO-1G143H受体片段(1 122 bp)的长度。将含有重组质粒的DH5α菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。与Genbank中的HO-1cDNA(NM010443)序列进行比对，序列完全一致，突变体也和预期完全一致。证明重组载体构建成功。

1：pcDNA3.1(+)-wtHO-1质粒；2：pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H质粒；M：Marker图1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/mtHO-1G143H质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳

2.2转染细胞外源性HO-1 mRNA表达水平检测 稳定转染的5个HepG2细胞克隆可见目的条带(长度为240 bp)。表明pcDNA3.1(+)-wtHO-1质粒已整合到该5个细胞克隆的基因组中，并在mRNA水平上表达。见图2。稳定转染的3个HepG2细胞克隆中可见目的条带。表明pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H质粒已整合到该3个细胞克隆的基因组中，并在mRNA水平得以表达。见图3。

2.3转染细胞HO-1蛋白表达水平检测 在分子量为32 kD附近检测出目的条带。转染空载体的HepG2细胞几乎看不到目的条带，而稳定表达wtHO-1和mtHO-1G143H的细胞系中HO-1蛋白表达丰度很高，说明实现了HO-1蛋白的过表达。见图4。

2.4HO-1活性改变对细胞周期调控因子CyclinE、p27 mRNA表达水平的影响 HO-1高活性细胞系和HO-1低活性细胞系中的CyclinE、p27的mRNA的表达水平与空载体细胞相比存在差异。见图5、表1。

M：Marker；1：转染空载体细胞；2～6：转染wtHO-1细胞图2 转染wtHO-1 mRNA表达水平

M：Marker；1：转染空载体细胞；2～6：转染mtHO-1G143H细胞图3 转染mtHO-1G143HmRNA表达水平

1：转染空载体HepG2细胞；2：稳定表达mtHO-1G143H的7号细胞；3：稳定表达wtHO-1的5号细胞图4 Western印迹检测转染细胞HO-1、HO-1(G143H)蛋白表达水平

1：转染空载体HepG2细胞；2：稳定表达wtHO-1的5号细胞；3：稳定表达mtHO-1G143H的7号细胞图5 HO-1稳转细胞系中CyclinE、p27 mRNA表达水平

表1 p27、CyclinE半定量

3 讨 论

HO-1是诱导型HO，是血红素分解的关键酶，它在炎症、免疫、氧化应激、细胞调节及细胞信号转导中发挥重要作用。它的生理作用是既可以清除过多的血红素，又可以通过其分解产物(胆绿素、CO和Fe2+)发挥抗炎、抗氧化、调节细胞增殖等作用。Hirai等〔5，6〕研究发现，某些肿瘤中能检测到HO-1高表达，抑制HO-1的表达能够抑制肿瘤的生长；Fang〔7〕等研究发现，HO-1的表达增强了胰腺癌的侵蚀性，主要是通过加快肿瘤生长和血管生成来实现的；有学者〔8〕研究提出HO-1的高表达具有抗氧化作用，保护癌细胞，利用药物抑制HO-1的表达，将成为治疗癌症的一种方法。也有一些文章报道HO-1可以抑制肿瘤生长，如：Hirai等〔9〕研究发现HO-1的表达可以抑制乳腺癌的生长，对肿瘤起抑制作用。有学者〔10〕发现HO-1启动子前GT序列的长短也与癌症的发生存在一定联系。

人类肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。现已发现癌基因和抑癌基因的作用点均是对细胞周期的调控。Abraham等〔11〕通过化学诱导和基因转染的方法观察了人微血管内皮细胞中HO-1在细胞周期进程中的作用，结果表明HO-1表达增高后CyclinE和CyclinD的表达上调，p21、p27、CDK2、CDK5、CDK6表达下调。CyclinE是G1期重要的周期蛋白，它与CDK2形成复合物，促进pRB磷酸化，使细胞通过限制点，启动S期〔12〕。CyclinE过表达将缩短G1期进程，导致细胞增殖失控，促使细胞恶化和肿瘤发生。CyclinE基因的扩增和过度表达在多种人类肿瘤中体现，它可协同某些癌基因转化细胞，增强细胞的癌变倾向。p27是1994年发现的一种分子量为27 kD的热稳定蛋白，它是一种广谱的CKI分子，可抑制CyclinE-CDK2和CyclinD1-CDK4的活性，阻滞细胞周期于G1期〔13〕。p27主要抑制CyclinE-CDK2的活性，并且p27与CyclinE-CDK2复合物之间存在一种相互制约关系。p27和CDK2结合后，通过调控细胞周期的G1/S期“Checkpoint”对细胞周期的发展起限速作用，控制细胞增殖和肿瘤形成。

mtHO-1G143H和wtHO-1一样能够结合血红素，但突变型不能将血红素分解，因此就造成了一种细胞内血红素分解产物减少的状态，可以利用HO-1活性增高和降低的细胞模型观察HO-1的功能是否通过其分解活性来实现。综上所述，HO-1活性改变可能与细胞周期调控有一定联系，HO-1的高表达有可能会影响肝癌细胞的细胞周期，进而影响细胞的增殖能力，其具体机制还需深入研究。