miR-411-5p靶向SPHK1基因调控宫颈癌细胞存活和凋亡的分子机制

王洪伟 林娟

(海南医学院第二附属医院妇产科，海南 海口 570311)

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，发病率较高，手术、放疗、化疗是目前主要治疗方式，虽取得一定效果，但对于晚期和复发转移的患者尚未有令人满意的治疗手段，因此探索和发展更有效的治疗方式有重要意义〔1〕。随着分子生物学的发展，靶向治疗成为癌症治疗新方法，能提高疗效、减少毒副作用〔2〕。微小RNA(miRNA)是一类内源性小分子非编码单链RNA，广泛参与转录后水平调控，研究发现其在宫颈癌的发生、发展过程中扮演重要角色，有望成为宫颈癌诊断的新标志物和治疗的新靶点〔3〕。研究表明在胃癌组织和细胞中miR-411-5p低表达，过表达miR-411-5p抑制胃癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡〔4〕。miR-411-5p过表达可降低黑色素瘤细胞A375增殖及侵袭能力，同时可降低癌相关成纤维细胞(CAF)侵袭能力〔5〕。鞘氨醇激酶(SPHK)1是一种致癌激酶，其在多种恶性肿瘤中上调表达，并与其进展相关〔6〕。干扰SPHK1基因表达可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移能力，诱导细胞凋亡〔7〕。宫颈癌组织中SPHK1的表达显著增加，与肿瘤大小、侵袭深度、FIGO分期、淋巴结转移和淋巴血管侵袭显著相关〔8〕。且还有研究发现miR-411在宫颈癌组织和细胞系中显著下调，miR-411的低表达与肿瘤大小、FIGO分期、淋巴结转移和远处转移相关，可通过直接靶向STAT3抑制宫颈癌的进展〔9〕。但miR-411-5p对宫颈癌存活和凋亡的影响及其分子机制是否与SPHK1有关尚未清楚。本研究探讨miR-411-5p是否通过SPHK1影响宫颈癌的存活和凋亡。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 正常宫颈细胞株Ect1/E6E7和宫颈癌细胞HeLa、SiHa、C33a、Caski购自上海细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；Trizol、荧光定量试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司、二辛可宁酸(BCA)试剂盒、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒；双荧光素酶检测试剂盒购自北京Solarbio公司。电泳仪、转膜仪及凝胶成像仪、酶标仪均购自美国BIO-RAD公司；流式细胞仪购自美国FACS caliber公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 正常宫颈细胞株Ect1/E6E7和宫颈癌细胞HeLa、SiHa、C33a、Caski用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于5%CO2，37℃的培养箱中培养。每天换液1次，待细胞融和至80%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2细胞转染 取对数生长期细胞SiHa培养12 h后更换培养基，将miR-con、miR-411-5p、anti-miR-con、anti-miR-411-5p、si-con、si-SPHK1分别转染至SiHa细胞中，分别记为miR-con组、miR-411-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-411-5p组、si-con组、si-SPHK1组；将miR-411-5p质粒分别与pcDNA、pcDNA-SPHK1共转染至SiHa细胞中，分别记为miR-411-5p+pcDNA组、miR-411-5p+pcDNA-SPHK1组。转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-411-5p表达水平 提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量使用说明配制反应体系，miR-411-5p以U6为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；72℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-411-5p上游引物：5′-TCGCTGTAGTAGACCGTAT-3′，下游引物：5′-GCACCTCAGGCTTGTACC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGCAGCACATATACTAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4Western印迹检测SPHK1、细胞核增殖抗原标志物(Ki67)、细胞周期素(Cyclin)D1、酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-9表达水平 提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。测浓度后上样，电泳90 min转膜至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭90 min后加入一抗4℃孵育过夜；TBST洗膜后加入二抗室温孵育2 h，再用TBST洗涤3次，每次5～10 min，显影，定影，用Quantity One凝胶分析软件处理，测各条带吸光度值，蛋白相对表达水平=目的条带吸光度值/β-actin条带吸光度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.2.5MTT检测细胞活性 各组细胞培养至48 h时，分别加入5 mg/ml MTT 10 μl，37℃继续培养4 h；1 000 r/min离心10 min，吸弃培养液，每孔加 150 μl的DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。然后在酶标仪上检测490 nm波长的吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后，1 000 r/min离心5 min，吸去培养液用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加入Annexin V-FITC和PI，37℃避光反应10 min，流式细胞仪检测激发光波长488 nm，发射波长560 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.2.7荧光素酶报告实验检测miR-411-5p对SPHK1的靶向调控 构建SPHK1的野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-SPHK1和MUT-SPHK1，用LipofectamineTM2000将WT-SPHK1和MUT-SPHK1分别与miR-con和miR-411-5p共转染至SiHa细胞中。按照说明书操作进行，检测荧光活性，实验重复3次。

1.3统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1宫颈癌细胞和正常宫颈细胞中miR-411-5p和SPHK1的表达 与正常宫颈细胞Ect1/E6E7相比，宫颈癌细胞HeLa、SiHa、C33a、Caski中miR-411-5p表达水平显著降低，SPHK1表达水平显著升高(P<0.05)，见图1，表1。

图1 Western印迹检测宫颈癌细胞和正常宫颈细胞中SPHK1蛋白的表达

表1 宫颈癌细胞和正常宫颈细胞中miR-411-5p和SPHK1的表达

2.2转染miR-411-5p对宫颈癌SiHa细胞存活的影响 与miR-con组相比，miR-411-5p组宫颈癌SiHa细胞中Ki67、CyclinD1表达水平显著降低，细胞活性显著降低(P<0.05)，见图2，表2。可见，miR-411-5p过表达抑制宫颈癌SiHa细胞存活。

图2 宫颈癌SiHa细胞Ki67和CyclinD1蛋白表达

表2 转染miR-411-5p对宫颈癌SiHa细胞存活的影响

2.3转染miR-411-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响 与miR-con组相比，miR-411-5p组宫颈癌SiHa细胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，见表3，图3。可见，miR-411-5p过表达促进宫颈癌SiHa细胞凋亡。

表3 转染 miR-411-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

图3 宫颈癌SiHa细胞凋亡和细胞中酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白表达

2.4miR-411-5p靶向调控SPHK1的表达 通过targetscan数据库预测到SPHK1与 miR-411-5p存在结合位点见图4A。荧光素酶报告基因检测实验结果显示，转染野生型和突变型SPHK1基因表达载体WT-SPHK1和MUT-SPHK1后，相较于miR-con组，miR-411-5p组WT-SPHK1细胞SiHa的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而MUT-SPHK1细胞SiHa的荧光素酶活性差异不显著。见表4。Western检测结果显示，相较于miR-con组SPHK1表达水平(0.68±0.08)，miR-411-5p组(0.19±0.36)显著降低；相较于anti-miR-con组SPHK1表达水平(0.71±0.08)，anti-miR-411-5p 组(1.25±0.11)显著升高(P<0.05)。见图4B。可见，miR-411-5p可靶向调控SPHK1的表达。

1～4：miR-con组、miR-411-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-411-5p组图4 miR-411-5p与SPHK1存在的互补核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5沉默SPHK1对宫颈癌SiHa细胞的存活和细胞凋亡的作用 与si-con组相比，si-SPHK1组宫颈癌SiHa细胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表达水平显著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表达水平显著升高，细胞活性显著降低；细胞凋亡率显著升高(均P<0.05)，见图5、表5。可见，沉默SPHK1抑制宫颈癌SiHa细胞的存活，促进细胞凋亡。

2.6过表达SPHK1部分逆转miR-411-5p对宫颈癌细胞存活和细胞凋亡的作用 与miR-con组相比，miR-411-5p 组宫颈癌细胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表达水平显著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表达水平显著升高，细胞活性显著降低；细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与miR-411-5p +pcDNA组相比，miR-411-5p+pcDNA-SPHK1组宫颈癌细胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表达水平显著升高，酶切caspase-3、酶切caspase-9表达水平显著降低，细胞活性显著升高；细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图6，表6。可见，过表达SPHK1部分逆转miR-411-5p对宫颈癌细胞存活抑制和凋亡促进作用。

图5 沉默SPHK1对宫颈癌SiHa细胞凋亡和各蛋白表达的影响

表5 沉默SPHK1抑制宫颈癌SiHa细胞存活和诱导凋亡的作用

1～4:miR-con组、miR-411-5p组、miR-411-5p+pcDNA组、miR-411-5p+pcDNASPHK1组图6 过表达SPHK1对宫颈癌SiHa细胞凋亡和各蛋白表达的影响

表6 过表达SPHK1和转染miR-411-5p表达对宫颈癌细胞存活和细胞凋亡的影响

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病机制尚未完全清楚，阐明宫颈癌发病相关RNA分子机制，可为宫颈癌的诊断和治疗提供新思路〔10〕。miRNA在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要调节功能〔11〕。研究显示miR-411-5p通过靶向GRB2抑制乳腺癌细胞的增殖和转移〔12〕。miR-411通过靶向ZnT1抑制膀胱癌细胞的生长和转移〔13〕。miR-411-5p通过靶向PUM1抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡〔14〕。本研究结果说明过表达miR-411-5p抑制宫颈癌细胞存活，促进细胞凋亡。CyclinD1是调控细胞周期G期的关键调控因子，其过量表达可使细胞增殖失调而促进癌变。Ki-67是细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，是反映细胞增殖的指标〔15〕。caspase-9活化可以激活caspase-3，而caspase-9和caspase-3活化裂解为酶切caspase-3和酶切caspase-9，促进细胞凋亡〔16〕。进一步说明过表达miR-411-5p抑制宫颈癌细胞存活，促进细胞凋亡。SPHK1与肿瘤细胞的存活、侵袭、迁移密切相关。有研究报道抑制SPHK1能引起细胞G1期阻滞及降低细胞侵袭能力〔17〕；抑制SPHK1可抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭并促进细胞的凋亡〔18〕。子宫内膜癌中SPHK1表达升高，其可能参与子宫内膜癌的发生发展〔19〕。本研究结果说明沉默SPHK1可抑制抑制宫颈癌细胞存活，促进细胞凋亡。与前人对SPHK1作用研究的结果相符。研究显示miR-506可通过靶向SPHK1抑制肝癌血管生成〔20〕。本研究结果提示miR-411-5p可能通过调控SPHK1影响宫颈癌细胞增殖和凋亡。