响应曲面优化提取半枝莲中总黄酮及清除DPPH 自由基作用的研究

李可同，李棣华，吕沅珊，刘俊红

（1.天津市环湖医院，天津 300222； 2.天津市南开医院，天津 300100）

中药半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）的干燥全草，主要在江苏、浙江、四川、广西等地分布，其味辛、苦，有清热解毒、止血、利尿的作用。半枝莲中黄酮类化合物［1］为其主要成分，还含有挥发性成分、多糖类和萜类化合物，黄酮类化合物具有降血压、调血脂、抗氧化的作用［2］，其在抗肿瘤方面也有很多报道［3-5］，临床上常和其他清热解毒类药物配伍来治疗和缓解肝癌［6］、直肠癌［7］等病情，在近年还研究其可抑制人肺腺癌A549 细胞的迁移［8］，肿瘤细胞的转移是肿瘤病人死亡的主要原因，此研究对半枝莲总黄酮在癌症方面的治疗提供了更多参考。

经查阅文献［9-10］，主要采用正交试验的方法来确定半枝莲中黄酮类化合物的最佳提取方案，虽然正交试验设计可考虑几种因素找出最佳水平组合，但其不能在整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，无法在整个区域内的找到最佳值，所以本试验通过Box-Behnken 响应曲面设计的方法［11-12］考查乙醇浓度、提取时间、提取次数、液料比等因素与总黄酮得率的关系，优化筛选半枝莲中总黄酮的最佳提取工艺，同时进行总黄酮提取物对DPPH 自由基的清除率的测定，初步评估其抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.1.1 药材 半枝莲生药，购于安国市弘发中药材饮片有限公司，产地：江苏，生产批号131201，粉碎后装密封袋。

1.1.2 主要试剂 乙醇为市售分析纯；甲醇为色谱纯，天津康科德科技有限公司；野黄芩苷对照品，批号110842-201207，中国食品药品鉴定研究院；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH 自由基），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；抗坏血酸，批号（津）XK13-011-00022，天津市化学试剂供销公司。

1.1.3 仪器 高速多功能粉碎机XY-500A 型，浙江省永康市松青五金工具厂；水浴锅，天津三水科学仪器有限公司；紫外分光光度计型号为U2800，日本日立高科技公司。

1.2 总黄酮的提取及含量测定 准确称取粉碎后的半枝莲粉末10 g，加入一定体积的乙醇，回流提取1 h，量取体积，摇匀，备用。用紫外分光光度计在335 nm 处测定半枝莲中总黄酮含量。准确称取野黄芩苷对照品2.4 mg 用甲醇溶解并定容至10 ml，取其中2.5 ml 至量瓶，继续加甲醇定容至25 ml，从中分别吸取0.5、1、2、3、4 和 5 ml 至 5 ml 量瓶中，分别加甲醇定容，摇匀，用紫外分光光度计在335 nm 下测定试液的吸光度值。测定野黄芩苷在不同质量浓度下溶液的吸光值后，绘制野黄芩苷的标准曲线，横坐标为野黄芩苷质量浓度，纵坐标为吸光度。半枝莲样品配制成50%甲醇水溶液，稀释至一定浓度测量吸光度，再通过标准曲线得到半枝莲样品中总黄酮浓度。得率=（C×V×n/M）×100%，C 为总黄酮浓度，V 为体积，n 为稀释倍数，M 为样品质量（10 g）。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 乙醇浓度对总黄酮提取工艺的影响 准确称取10 g 半枝莲粉末，加入乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加热回流1 h，提取次数为2 次，加入乙醇的浓度分别设定为20%、40%、60%、80%和纯水。

1.3.2 液料比对总黄酮提取工艺的影响 准确称取10 g 半枝莲粉末，加入40%浓度乙醇，在80 ℃水浴上加热回流1 h，提取次数为2 次，乙醇用量分别设定为1∶8、1∶10、1∶12 和 1∶15。

1.3.3 提取次数对总黄酮提取工艺的影响 准确称取10 g 半枝莲粉末，加入40%浓度乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加热回流1 h，提取次数分别设定为1、2 和3 次。

1.3.4 提取时间对总黄酮提取工艺的影响 准确称取10 g 半枝莲粉末，加入40%浓度乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加热回流，提取次数为3 次，回流时间分别设定为 1、1.5 和 2 h。

1.4 响应曲面设计 在单因素试验基础上，综合考虑各因素对半枝莲中总黄酮得率的影响，借助Design-Expert 8.0.6 软件，采用Box-Behnken 响应曲面设计法以乙醇浓度、加热回流提取时间、乙醇用量为自变量，以半枝莲中总黄酮得率为指标，设计3 水平3 因素的响应曲面设计方案，从中筛选最佳提取方案，因素、编码及水平设计见表1。

表1 响应曲面分析试验因素及编码水平

1.5 DPPH 自由基清除能力试验 参考文献除DPPH自由基的试验方法［13-15］，准确称取 DPPH 16.7 mg，用甲醇定容至200 ml，所得到浓度为0.083 5 mg/ml,避光放置。将最佳提取条件所得到的浓缩液用50%甲醇溶液稀释成 10 mg/ml，再稀释配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和 0.8 mg/ml，取 700 μl 加入到量瓶中，在量瓶中各加入2 500 μl 上述配置好的DPPH 溶液，混匀，避光放置30 min，在紫外分光光度仪517 nm 下测定吸光度值，平行3 次，取其平均值，计算半枝莲中总黄酮的清除率。清除率（%）=［1-（A1-A2)/A0］×100，式中 A0为50%甲醇 700 μl+2 500 μl DPPH 的吸光值；A1为样品溶液 700 μl+2 500 μl DPPH 的吸光值；A2为样品溶液700 μl+2 500 μl 甲醇的吸光值。同法以相同浓度的抗坏血酸，做对照试验，计算抗坏血酸清除率。

2 结果与分析

2.1 半枝莲总黄酮含量测定结果 以野黄芩苷为对照品，按“1.2”项下所述方法操作，得到标准曲线，求得回归方程Y=0.026 9 X+0.057 5（r=0.999 5）。野黄芩苷在2.4~19.2 μg/ml 浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.7 设计方法：处理和对照均为绥农26号大豆品种，公顷用48%开磷复合肥200kg，加入50%硫酸钾50kg，均为5月11日播种，公顷用大豆种子为55kg。播种后第三天，即5月14日，用99%乙草胺1800mg/公顷+75%噻吩磺隆30g/公顷，兑水500kg/公顷，封闭灭草。田间管理均为趟两遍地，苗后茎叶处理用25%氟磺胺草醚2000ml/公顷+12%烯草酮1200ml/公顷兑水320kg均匀喷雾，秋后拿一遍大草。田间防治病虫害时用药剂及时防治，大豆食心虫防治时间为8月7日，通过秋季测产及收获看，食心虫防效甚好，虫食率较低。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取工艺的影响 试验结果显示出随乙醇浓度的不断增加，半枝莲中总黄酮得率逐渐增大当乙醇浓度到达40%时，其得率最高,但随后随浓度升高而下降，可能乙醇浓度过大时半枝莲其他杂质也会溶出，从而导致总黄酮得率降低。综合考虑，确定乙醇最佳浓度为40%。

2.2.2 液料比对总黄酮提取工艺的影响 试验结果显示出随乙醇用量的增加，半枝莲中总黄酮得率也逐渐增大，还要结合经济方面的考虑，液料比在1∶15 左右为宜。

2.2.3 提取次数对总黄酮提取工艺的影响 试验结果显示出随提取次数的增加，半枝莲中总黄酮得率明显增加，以3 次提取为最佳，所以固定提取次数定为3 次。

2.2.4 提取时间对总黄酮提取工艺的影响 试验结果显示出提取时间在1~2 h 内随提取时间的增加，半枝莲中总黄酮得率逐渐增大，但1.5 和2 h 得率差别不大，因此，提取时间设定为1.5 h。

2.3 响应曲面试验结果分析

2.3.1 回归模型方程的建立与分析 利用软件Design-Expert 8.0.6 进行试验设计，共17 个试验点进行试验，响应曲面方案及半枝莲总黄酮得率见表2，并对试验数据进行回归拟合，得到半枝莲总黄酮得率（Y）对乙醇浓度（A）、提取时间（B）、液料比（C）的二元多次回归模型方程：Y=2.16+0.3 A+0.13 B+0.098 C-0.12 AB-0.032 AC+0.069 BC-0.24 A2-0.036 B2-0.072 C2。回归模型显著性见表3。由表3可知：该模型的F=22.14，P=0.000 2<0.05，表明所得模型极显著，失拟项为P=0.069 5>0.05，不显著，表明试验结果主要受所选因素影响受其他因素影响很小，方程式成立方法可靠。模型的复合相关系数R2=0.966 1，说明了该模型拟合程度良好，可以用该模型优化半枝莲中总黄酮的提取工艺。模型一次项中3个因素乙醇浓度、提取时间和液料比对半枝莲中总黄酮得率的线性效应均有显著影响，其影响力大小顺序为乙醇浓度（A）>提取时间（B）>液料比（C）。乙醇浓度与提取时间交互作用对结果影响显著。二次项中乙醇浓度对结果影响极显著。

表2 Box-Behnken 响应曲面设计及试验结果

表3 回归方程方差分析

2.3.2 各因素之间的交互作用 该模型各模型之间的交互作用的响应曲面图及等高线图见图1-3。曲面越弯曲显著性越高。等高线图的形状能两者间反应交互影响的强弱，椭圆形的等高线图表示两个条件交互作用明显，而圆形相对较差，所得3 个图中都为椭圆形证明交互作用都很明显。

图1 乙醇浓度与提取时间交互作用响应曲面

图2 乙醇浓度与液料比交互作用响应曲面

图3 提取时间与液料比交互作用响应曲面

图1 为乙醇浓度与提取时间交互作用对半枝莲中黄酮得率的影响。在提取时间固定不变时，半枝莲中黄酮得率随乙醇浓度升高逐渐升高，浓度在65%以上得率有轻微下降的趋势；在乙醇浓度固定不变时，半枝莲中黄酮得率随提取时间的增加而逐渐增大。在本试验范围内选择较长的提取时间和适宜的乙醇浓度就可得到较高的黄酮得率。

图2 为乙醇浓度与液料比交互作用对半枝莲中黄酮得率的影响。在液料比固定不变的条件下，半枝莲中黄酮得率随乙醇浓度升高逐渐升高，到达顶点时再升高浓度得率反而会有下降趋势；在乙醇浓度固定不变时，半枝莲中黄酮得率随液料比加大而略有增加。在本试验范围内选择较高的液料比和适宜的乙醇浓度可得到较高的黄酮得率。

图3 为提取时间与液料比交互作用对半枝莲中黄酮得率的影响。在液料比固定不变的条件下，随提取时间的增加黄酮得率逐渐增加；在提取时间固定不变时，随液料比的加大黄酮得率增加但并不十分显著。在本试验范围内选择较高的液料比和较长的提取时间可以得到较高的黄酮得率。

2.3.3 模型验证性试验 通过Design-Expert 8.0.6 分析得出半枝莲中总黄酮的最佳提取工艺为：半枝莲10 g，乙醇浓度为59.43%，提取时间为2 h，液料比为1∶15，在最佳工艺条件下预测的半枝莲中总黄酮得率为2.372%。为了提取工艺的可行性，将上述条件修正为：半枝莲10 g，乙醇浓度为59%，提取时间为2 h，液料比为1∶15。并以此进行验证，验证3 次，得到半枝莲中总黄酮的平均得率为2.366%，与预测值非常接近，故响应曲面得到最优试验条件可行可靠。

2.4 DPPH 清除能力试验 随着半枝莲黄酮提取物的质量浓度的增加（0.1~0.8 mg/ml），半枝莲黄酮提取物对DPPH 自由基清除率从21.85%上升到92.06%。虽然与同等质量浓度的抗坏血酸相比，半枝莲黄酮提取物对DPPH 自由基清除率整体要低于抗坏血酸对DPPH 自由基的清除率，但其高浓度下已和抗坏血酸的清除率很接近，表明半枝莲中黄酮提取物有很好的抗氧化性。见图4。

图4 半枝莲黄酮提取物和抗坏血酸对DPPH 自由基的清除作用

3 讨论

采用加热回流的方法对半枝莲中的总黄酮进行提取，通过单因素试验筛选出3 次提取为最佳提取次数，其他3 项指标由Box-Behnken 响应曲面分析法结合单因素试验结果，得出最佳提取工艺条件：乙醇浓度为59%，提取时间为2 h，液料比为为1∶15，此条件下提取10 g 半枝莲粉末所得半枝莲中总黄酮得率为2.372%，与验证实际值2.366%，预测值与实际值接近，证明采用响应曲面的试验方法是可靠的，并且相比于传统的正交试验，响应曲面法能在整个区域间找到因素与响应值之间明确的回归方程，使最佳值更精确，所得三维立体图能更直观看出因素之间的变化，为合理利用半枝莲以至于中药都有很重要的意义。

通过对DPPH 自由基清除能力试验得知半枝莲中黄酮提取物对DPPH 自由基的清除能力有浓度依赖性，在黄酮提取物质量浓度为0.8 mg/ml 时，清除率可达92.06%，接近于抗坏血酸的抗氧化能力，表明半枝莲中的总黄酮具有较好的抗氧化能力，为以后半枝莲在药品中更好的利用提供依据。