参附强心丸对心肾综合征模型大鼠心肾组织自噬蛋白Beclin-1 和LC3 表达的影响

商丹丹，李 旭，郝 迪，王 蕾，刘 淑

（1.天津中医药大学，天津 301617； 2.天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，天津 300457； 3.天津市医药科学研究所，天津 300020）

心肾综合征是心脏或肾脏由于急性或慢性功能障碍而导致另一器官急性或慢性功能损伤的临床综合征，多以难纠正的心力衰竭或肾功能衰竭为特点［1-2］。中医认为慢性心脏衰竭发展到终末期与心、肾两脏关系最为紧密［3-4］。临床研究显示，从补气温阳角度实现对患者的治疗，从而能够延缓疾病的发展进程［5］。本实验运用实验性CRS 动物模型作为研究对象，采用“益气温阳、活血利水”法代表方参附强心丸作为受试药物，求证了该药调控心肾细胞自噬作用来延缓心肾共损疾病的发展进程。

1 材料

1.1 仪器 电子天平（BSA124S-CW Sartorius 公司，德国），移液枪（Eppendorf 公司，法国），微量加样吸头（北京中衫金桥生物有限公司），－80 ℃低温冰箱（青岛海尔），4 ℃低温冰箱（青岛海尔），高速离心机（Eppendorf公司，德国），电泳仪、凝胶玻璃板、固定夹、垂直电泳槽、转移槽（北京六一仪器厂），转移脱色摇床NMYC-60（泰州诺米医疗科技有限公司）。

1.2 药品与试剂 参附强心丸（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，药品规格：铝塑薄膜袋，密封包装，阴凉干燥贮藏，每袋装2.7 g，批号7668002；大黄素和大黄分含量不得少于0.21 mg/g；有效期18 个月）；雷帕霉素（1 g，源叶生物，批号 H12J10J79598）；大鼠血管 紧 张 素 转 换 酶 ELISA 试 剂 盒（SAB，EK1009，9J281l）；精氨酸加压素 ELISA 试剂盒（SAB，EK2822，9J281l）；甲 状 腺 素 ELISA 试 剂 盒（SAB，EK1787，9J281l）；细胞裂解液试剂盒（碧云天，产品编号：P00138）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型，碧云天，产品编号：P0010）；5X 蛋白上样缓冲液（碧云天，产品编号：P0015）；Western 一抗稀释液（碧云天，产品编号 ：P0023A）；Beclin -1 抗 体 （ABcloned， 批 号3507223001）；MAPLC3B 抗体（SAB，批号 6N26）；山羊抗兔抗体（博士德，批号201806）；山羊抗鼠抗体（博士德，批号201806）；超敏ECL 化学发光试剂盒（万类生物，批号 17122220）。

1.3 动物 SD 种大鼠，60 只，雄性，体重 220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，试验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。购入后动物活动正常，毛发柔顺，饮食、饮水均正常。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药 采用腹主动脉缩窄合并肾脏急性缺血再灌注损伤制备心肾综合征大鼠模型［6］。大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射45 mg/kg 麻醉后，行腹部正中切开，沿腹白线进入腹腔，暴露分离左、右侧肾蒂，阻断结扎30 min 后，解除阻断，恢复血流，造成急性缺血再灌注损伤。随后暴露分离后腹膜，在左肾动脉上方游离腹主动脉。沿游离腹主动脉长轴置一折弯的7 号针头，以3-0 的丝线绕腹主动脉后与7 号针头一起结扎，随后立即抽出针头，使腹主动脉残留直径为0.7 mm 的残腔，造成腹主动脉狭窄。假手术组只分离肌肉、血管，但不缩窄。术后腹腔内滴入青霉素预防感染，分层关闭腹腔。将造模后12 周将存活动物按体重随机分为5组，分别为假手术组（n=10）、模型对照组（n=10）、参附强心丸高剂量组（n=10；灌胃剂量为3.24 g/kg，相当于临床用量12 倍）、参附强心丸低剂量组（n=10；灌胃剂量为1.62 g/kg，相当于临床用量6 倍）和雷帕霉素组（n=10；灌胃剂量为2 mg/kg）。灌胃体积10 ml/kg，假手术组和模型组灌胃同体积饮用水。所有组别均从手术后8 周开始给药，1 次/d，持续4 周。参附强心丸和雷帕霉素均采用纯净水进行配制，每天配制1 次。

2.2 指标检测

2.2.1 血清中血管紧张素、甲状腺激素及精氨酸加压素测定的影响 于末次给药24 h 后大鼠经麻醉，腹主动脉取血，于3 500 r/min 离心10 min 后，取血清测定血管紧张素、甲状腺激素及精氨酸加压素的含量。

2.2.2 心室及肾脏重量指数的影响 取血完成后，分别将大鼠心脏及左肾脏取出，分离心室，称量心室湿质量、全心湿质量、左肾脏湿质量，计算心室指数、全心指数、左侧肾脏指数。计算公式如下：心室指数=心室肌湿重/体质量×100%，全心指数=全心肌湿重/体质量×100%，左肾指数=左肾脏湿重/体质量×100%。

2.2.3 心脏、肾脏LC3 和Beclin-1 蛋白的表达 取血完成后，分别将大鼠心脏及左肾脏取出，分离心室和左肾，切半，一半冻存于-80 ℃冰箱中，待测备用，采用蛋白质印迹法（western blotting）进行测定。具体步骤：提取心室和左肾的总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，充分匀浆，取上清液加入缓冲液，加热。取等量蛋白进行电泳，转移蛋白至硝酸纤维素膜，7% 脱脂奶粉封闭后，一抗4 ℃孵育过夜，洗涤，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育1 h，洗涤，加入增强化学发光（ECL）试剂，显影，定影，分析条带光密度值。以目的条带与内参β-action 条带的光密度值的比值作为衡量参数，分析LC3 和Beclin-1 蛋白的表达量［7］。

2.3 统计学处理 用SPSS 17.0 统计学软件进行分析。实验数据以±s 表示。假手术组和模型对照组比较采用t 检验，模型对照组与给药各组之间比较采用方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 血清中血管紧张素、甲状腺激素及精氨酸加压素测定结果 与假手术组比较，模型对照组大鼠血清中血管紧张素（ACE）水平显著增加，甲状腺激素（fT3）及精氨酸加压素（AVP）水平显著降低（P＜0.01）。与模型对照组比较，参附强心丸高剂量组大鼠血清中激素水平均明显改善（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清血管紧张素、甲状腺素和精氨酸加压素含量测定结果（±s）

表1 各组大鼠血清血管紧张素、甲状腺素和精氨酸加压素含量测定结果（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 ACE（ng/ml） fT3（pg/ml） AVP（pg/ml）假手术 10 0.086±0.020 2.214±1.114 2 532.468±1 442.549模型对照 7 0.432±0.184** 0.743±0.322** 517.236±203.246**参附强心丸高剂量 8 0.214±0.043# 1.871±0.386## 2 183.680±1 481.680##参附强心丸低剂量 8 0.280±0.080 1.415±0.439 1 665.222±1 157.243雷帕霉素（RP） 8 0.285±0.126 1.153±0.484 1 442.334±1 263.106

3.2 各组动物心脏及肾脏重量指数 与假手术组比较，模型对照组大鼠全心指数和左肾指数均显著增加（P＜0.05），说明该模型方法对心肾组织病理的发生进程均有影响。与模型对照组比较，参附强心丸高剂量组大鼠全心指数和左肾指数均降低显著（P＜0.01，P＜0.05），说明给药后可明显改善心肌肥厚，肾脏肿大的状态。见表2。

3.3 心脏、肾脏LC3 和Beclin-1 蛋白的表达 与假手术组（Sham）比较，模型对照组（model）心肾组织中LC3的表达均明显升高（P＜0.05），给予参附强心丸高剂量组后，心肾组织中LC3 的表达出现明显下调（P＜0.05）。而对于Beclin-1 的表达，心肾组织中的表达明显不同，模型对照组心脏中的Beclin-1 表达较假手术组明显上调（P＜0.05），而肾脏中的 Beclin-1 的表达明显下调（P＜0.05），说明在心肾同病的病理状态下，Beclin-1 的调控在两种组织中有所不同。给予参附强心丸高剂量（SFQX-H）组后，Beclin-1 的表达与假手术组相近，与模型对照组具有统计学差异（P＜0.05）。数据见图1。

表2 各组大鼠心脏肾脏组织重量指数结果（±s）

表2 各组大鼠心脏肾脏组织重量指数结果（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 心脏指数（g/100 g） 肾脏指数（g/100 g）假手术 10 0.247±0.537 0.268±0.066模型对照 7 0.430±0.089** 0.341±0.034*参附强心丸高剂量 8 0.299±0.022## 0.268±0.022#参附强心丸低剂量 8 0.346±0.020# 0.310±0.042雷帕霉素（RP） 8 0.352±0.051# 0.323±0.070

图1 各组大鼠心脏、肾脏LC3、Beclin-1 蛋白的表达结果

3 讨论

心肾综合征是心脏和肾脏由于一种器官急性或慢性功能不全而导致另一器官急性或慢性功能损害的临床综合征，以尿量显著减少、顽固性水肿、喘憋不能平卧等为主要临床表现，多以难纠正的心力衰竭或肾衰竭为其主要特点［8］。参附强心丸是天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂研制的国家中药保护品种，具有益气助阳，强心利水功效，临床用于慢性心力衰竭，属心肾阳衰者治疗药物［9-10］。本实验旨在阐明“益气温阳，活血利水”治法对心肾共损后治疗机制与调控心肾组织细胞自噬通路有关。并为CRS 临床用药提供了重要的药理学参考。

研究表明，肌体组织受到损伤后，会通过激活自噬或者凋亡来维持内环境的氧化还原稳态［11］。细胞中的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是调节自噬的关键因子［12］。mTOR 的活化状态抑制细胞的自噬作用。Beclin-1 也是近年发现参与自噬调控的蛋白之一［13-15］，Beclin-1 表达的增加被认为是一种应激反应，其作为自噬表达产物的变化反映了细胞代谢的异常，Beclin-1 也成为人工干预自噬活性的靶点之一。本研究采用参附强心丸对实验性心肾综合征大鼠模型进行了调控细胞自噬作用机制的探讨，结果发现，该药明显改善模型大鼠心肾组织中自噬相关因子LC3 和自噬基因Beclin-1 的表达，这也进一步诠释参附强心丸在治疗心肾共损疾病中的作用机制，明确揭示了“益气温阳、活血利水”的方药能通过调控细胞自噬以达到抑制心肾衰竭的作用。这为参附强心丸调控心肾组织细胞自噬作用治疗机制提供了基础研究的数据支持。