阳离子交换固相萃取结合LCMS-IT-TOF 的中风回语颗粒化学成分分析

张 君，霍志鹏，张依倩，王 玉，4，何 毅*

（1.天津中医药大学，天津 301617； 2.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津 300410； 3.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410； 4.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

中风回语颗粒用于治疗缺血性脑中风引起的痰瘀阻络症，源自国医大师任继学教授多年临床经验，由石菖蒲、酒大黄、胆南星、冰片、黄连、远志、川芎、郁金、土鳖虫九味中药组成［1］，具清热化痰、活血通络、开窍之功效，其散剂作为长春中医药大学附属医院的院内制剂已在临床应用十余年［2］。现代药理学研究表明，中风回语颗粒具有抗氧化、抗炎、减轻脑水肿、抗凝血等作用［2-4］。目前已获得临床批件，处于临床Ⅱ期研究阶段，其相关质量标准由方中黄连、远志、酒大黄、冰片的鉴别及盐酸小檗碱的含量测定组成，但针对中风回语颗粒的物质基础尚无全面系统研究。

液质联用（LC-MS）技术具有灵敏度高、分辨率高、特异性强等特点，广泛用于中药材及中成药的定性分析。中风回语颗粒由九味中药组成，基质复杂，含量不均一，黄连药材的生物碱类成分在该制剂中含量较高，在LC-MS 鉴定中，生物碱类成分峰响应值偏高，导致其他成分响应差，检出成分数量偏少。因此，去除或减少样品中含量多的成分，可减少共出峰物对离子的抑制作用，增加峰容量，以提高色谱分辨率。固相萃取是对样品成分富集的有效方式，具有较高的选择性，本研究在中风回语颗粒提取物的基础上，采用PCX-SPE 分离富集，截留生物碱类成分，结合LCMS-IT-TOF 技术对提取物及分离富集物峰指认及信息归属，对比分析固相萃取前后成分变化，以期为含黄连复方中药的LC-MS 成分鉴定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LCMS-IT-TOF 型液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪（日本岛津公司，包括自动进样器、二元梯度泵、柱温箱和PDA 检测器）；Milli-Q 型超纯水系统（美国Millipore 公司）；KQ-500DV 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；XS205DU 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI有限公司）；PCX-SPE 柱（500 mg/6 ml，Agela 科技）。

1.2 试药 中风回语颗粒（批号20190301，天士力研究院自制）；石菖蒲（批号20190101）、郁金（批号20190102）、远志（批号 20190501）、黄连（批号20190103）均购自安徽省永香中药饮片有限公司；酒大黄（批号20190201）购自河北蔺氏盛泰；川芎（批号1810001）天士力现代中药资源公司提供；土鳖虫（批号20190402）购自安徽贺林；胆南星（批号20190101）购自四川辅正药业股份有限公司，药材均经过天士力研究院霍志鹏中级工程师鉴定和天士力现代中药资源有限公司检测，均符合2015 年版《中国药典》一部项下要求。碘化木兰花碱对照品（批号10112703）购自天津一方科技有限公司；黄连碱对照品（批号MUST-12111602）购自成都曼思特生物技术有限公司；盐酸药根碱对照品（批号110733-201007）、盐酸巴马汀对照品（批号110732-200506）、盐酸小檗碱对照品（批号110713-201814）、大黄酸对照品（批号 110757-201607）、芦荟大黄素对照品（批号 110795-200806）、大黄素对照品（批号110756-201913）、大黄酚对照品（批号110796-201922）、大黄素甲醚对照品（批号110758-201415）、细叶远志皂苷对照品（批号111849-201705）、3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品（批号 111848-201303）、远志酮 Ⅲ对照品（批号111850-201705）、欧当归内酯A 对照品（批号111826-201806）均购自中国食品药品检定研究院；β-细辛醚对照品（天士力研究院自制），α-细辛醚对照品（批号L1913066）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈（质谱纯，德国默克公司）；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；冰乙酸（色谱纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备 取中风回语颗粒，研细，称取约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声提取 30 min（功率 250 W，频率 40 kHz），冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液Ⅰ。依次用5 ml 甲醇和5 ml 水活化PCX-SPE 柱，准确移取10 ml 供试品溶液Ⅰ上柱，收集流出液，依次用水、50%甲醇水、甲醇各5 ml 淋洗PCX-SPE 柱，收集各淋洗液，流出液与各淋洗液合并，浓缩至干，用1 ml 甲醇复溶，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液Ⅱ。

2.2 单味药材溶液的制备 取石菖蒲、郁金、川芎、黄连、酒大黄、远志、土鳖虫、胆南星各药材粉碎，称取适量，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，为各单味药材溶液。

2.3 对照品溶液的制备 取碘化木兰花碱、盐酸药根碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅰ。取大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、细叶远志皂苷、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酮 Ⅲ、欧当归内酯 A、β-细辛醚、α-细辛醚对照品适量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅱ。

2.4 色谱条件 Dimonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相 A 为 20.02 mmol/L 乙酸铵-0.5%乙酸水溶液，流动相B 为乙腈，按照表1 中的规定进行梯度洗脱，柱温 30 ℃，流速 1 ml/min，进样量 10 μl。

2.5 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正负离子分别检测，扫描范围为m/z 100～1000，采用三氟醋酸钠作为校正液，检测电压1.7 kV，雾化气体积流量1.5 L/min，曲型脱溶剂装置（CDL）温度200 ℃，离子累积时间50 ms，毛细管电压-3.5 kV（负离子），4.5 kV（正离子），诱导碰撞解离能（CID）50%，柱后分流，分流比 1∶3。

表1 梯度洗脱程序

3 结果与分析

3.1 鉴定结果 根据化合物准确分子质量及碎片离子信息，对照品比对，并结合国内外相关文献与数据库比对，对中风回语颗粒供试品溶液Ⅰ与Ⅱ进行分析，分别鉴定出33 和71 个化学成分，其中11 个化学成分包括蔗糖、没食子酸、阿魏酰基奎宁酸异构体、西伯利亚远志糖A6、羧基大黄酚-O-葡萄糖苷、远志酮 Ⅲ、虫漆酸D、大黄素-8-O-葡萄糖苷/大黄素-1-O-葡萄糖苷、小檗碱、大黄素、Magnosalicin 是两种提取方式共同鉴定的，如图1 所示。中风回语颗粒供试品溶液Ⅰ与Ⅱ的正负离子模式下总离子流图分别见图2 与图3。各化合物通过药材图谱与文献及数据库对照进行了归属确认。鉴定结果见表2 和表3。

图1 中风回语颗粒供试品溶液Ⅰ与Ⅱ化学成分分析的韦恩图

3.2 生物碱类成分 中风回语颗粒中生物碱类成分较多，共鉴定出23 个生物碱成分，主要来自于黄连，其裂解方式主要是母核一般不会裂解，仅有小分子取代基的裂解与丢失。

图2 中化合物11 保留时间为15.78 min，正离子模式下检测到分子离子峰为342.168 9［M］+，丢失C2H7N形成 m/z 297［M-C2H7N］+，然后脱去甲基形成 m/z 282［M-C2H7N-CH3］+，脱羟基形成 m/z 265［M-C2H7NCH3-OH］+，进一步脱去羰基形成 m/z 237［M-C2H7NCH3-OH-CO］+，根据文献［26］报道鉴定此化合物为木兰花碱。

图3 中风回语颗粒供试品溶液Ⅱ正离子模式（C）和负离子模式（D）的总离子流

图2 中化合物29 保留时间为29.12 min，正离子模式下检测到分子离子峰为m/z 336.120 9［M］+，脱甲基形成 m/z 321［M-CH3］+、320［M-CH3-H］+碎片离子，侧链环合成五元含氧杂环，进一步脱去CO，形成m/z 293［M-CH3-CO］+、292［M-CH3-H-CO］+碎片，裂解规律如图4 所示，根据对照品比对和文献［26］报道鉴定此化合物为小檗碱。

3.3 蒽醌类成分 从中风回语颗粒中鉴定了14 个蒽醌类成分，以游离或者苷类形式存在，蒽醌类化合物来自于酒大黄。结合型蒽醌在电喷雾电离下容易失去糖基离子，游离型蒽醌在高能碰撞下易脱去CO、CO2、CH3等碎片离子。

表2 中风回语颗粒供试品溶液Ⅰ化学成分分析

续表2 中风回语颗粒供试品溶液Ⅰ化学成分分析

图3 中化合物39 的保留时间为28.51 min，正离子模式下检测到分子离子峰为m/z 439.098 0［M+Na］+，脱去一分子葡萄糖形成255［M+H-Glc］+的碎片离子，负离子模式下检测到分子离子峰为415.103 7［M-H］-，脱去一分子葡萄糖，形成253［M-H-Glc］-的碎片离子，参照文献［7］裂解规律鉴定此化合物为大黄酚-O-葡萄糖苷。

图3 中化合物58 为的保留时间为48.41 min，负离子模式下检测到分子离子峰为m/z 269.046 8［M-H］-，脱去一分子CO，形成241［M-H-CO］-的碎片离子，脱去一分子 CO2形成 225［M-H-CO2］-，相继脱去一分子甲基形成210［M-H-CO2-CH3］-的碎片离子，裂解规律如图5 所示，根据对照品比对和文献［7］报道鉴定此化合物为大黄素。

图4 小檗碱裂解途径

图5 大黄素裂解途径

表3 中风回语颗粒供试品溶液Ⅱ化学成分分析

续表3 中风回语颗粒供试品溶液Ⅱ化学成分分析

续表3 中风回语颗粒供试品溶液Ⅱ化学成分分析

3.4 糖酯类成分 中风回语颗粒所含的药材远志中含有远志糖酯类化学成分，从中鉴定了6 个糖酯类化合物，该类成分主要发生糖苷键裂解或芥子酰基丢失。

图2 中化合物6 的保留时间为11.68 min，分子离子峰为m/z 571.163 9［M+Na］+，脱去一分子葡萄糖与水形成 m/z 369［M+H-C6H10O5-H2O］+的碎片离子，根据文献［8］报道推测出该化合物为西伯利亚远志糖A6。

图3 中化合物27 的保留时间为20.81 min，在负离子模式下检测到分子离子峰m/z 681.201 8［M-H］-，相继脱去一个芥子酰基、甲基与羟基形成m/z 443［MH-sinapoyl-CH3-OH］-，根据文献［8］报道鉴定此化合物为远志蔗糖酯A。

3.5 酮类成分 从中风回语颗粒中鉴定出8 个酮类成分，其中酮类成分主要来自于远志，该类成分在正离子模式下二级碎片离子中常出现419、317、287 等碎片离子。

图3 中化合物15 的保留时间为16.53 min，正离子模式下检测到m/z 569.151 9［M+H］+，二级质谱中出现m/z 419［M+H-C5H10O5］+、401［M+H-C5H10O5-H2O］+、383［M+H-C5H10O5-H2O-H2O］+、317［M+H-C5H7O4-C7H4O2］+，287［M+H-C5H7O4-C7H4O2-CH2O］+等碎片离子。负离子模式下检测到m/z 567.135 5［M-H］-，二级碎片含有m/z 345［M-H-Api-C3H4O2］-、315［M-H-Api-C4H6O3］-，裂解规律如图6 所示，根据对照品比对及文献报道［8］鉴定此化合物为远志酮Ⅲ。

图6 远志口山酮 Ⅲ裂解途径

3.6 内酯类成分 从中风回语颗粒中鉴定出12 个内酯类成分，主要来自于川芎。此类成分在正离子模式下响应较好。

图3 中化合物65 的保留时间为53.63 min，正离子模式下检测到分子离子峰m/z 209.115 6［M+H］+，推测其分子式为C12H16O3，脱去一分子甲基形成m/z 194［M+H-CH3］+，脱去一分子 CO 形成 m/z 181［M+H-CO］+，脱去一分子 C4H8与 H2O 形成 m/z 135［M+H-H2O-C4H8］+的碎片，因此推测此化合物为洋川芎内酯K。

图3 中化合物64、69 在正离子模式下检测到分子离子峰 m/z 398.23［M+NH4］+、381.21［M+H］+，二级质谱中均出现 m/z 191［C15H12O2］+的碎片离子，根据文献［13］报道和对照品比对推测出化合物64 和69 分别为双藁本内酯和欧当归内酯A，欧当归内酯A 的裂解途径如图7 所示。

图7 欧当归内酯A 裂解途径

3.7 苯丙素类成分 从中风回语颗粒中共鉴定出20个苯丙素类成分，包括简单苯丙素类与木脂素类成分。

木脂素类成分：图3 中化合物12 的保留时间为14.30 min，在正离子模式下检测到m/z 540.245 3［M+NH4］+、545.191 6［M+Na］+，在电喷雾电离下形成 m/z 219［M+H-Glc-C7H10O3］+的碎片离子，负离子模式下检测到m/z 521.191 6［M-H］-，脱去一分子的葡萄糖形成 m/z 359［M-H-Glc］-，之后脱去 CH3形成 m/z 344［M-H-Glc-CH3］-的碎片离子。根据文献［7］报道鉴定此化合物为Isolarisiresinol-O-glucoside/Lariciresinol-O-glucoside。

图3 中化合物66 的保留时间为54.59 min，在正离子模式下检测到 m/z 434.254 8［M+NH4］+、417.238 6［M+H］+，在电喷雾电离下形成 m/z 249［M+H-C9H12O3］+、209［C12H17O3］+、181［C10H13O3］+的碎片离子。裂解规律如图8所示，根据文献［12］报道鉴定此化合物为Diasarone I，此化合物来自于石菖蒲。

图8 Diasarone I 裂解途径

简单苯丙素类成分：图2 中的化合物5、7、8 在负离子模式下均检测到分子离子峰m/z 367.10［M-H］-，推测其结构式为C17H20O9，二级碎片离子中检测到m/z 193［ferulic acid-H］-、161［ferulic acid-H-OH-CH3］-、133［ferulic acid-H-CH3-COOH-H］-等碎片离子，根据文献报道［6，13］鉴定化合物为阿魏酰奎宁酸及其异构体。

此外本研究还鉴定出4 个鞣质类、1 个三萜皂苷类、1 个糖类、1 个胆酸类、3 个其他类成分。

4 讨论

本实验对色谱条件进行了优化，首先采用水-乙腈、0.05%甲酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱，发现黄连生物碱色谱峰分离度较差，改用离子对试剂20.02 mmol/L乙酸铵-0.5%乙酸水溶液作为A 相流动相，乙腈为B相流动相，各色谱峰分离度理想［11］。前期研究发现中风回语颗粒中所含的部分生物碱类成分浓度过大，残留于质谱系统，导致部分成分难以检测。因此中风回语颗粒样品前处理时采用PCX-SPE 柱对提取液分离富集。

本研究首次采用甲醇提取与PCX-SPE 结合LCMS-IT-TOF 的方法系统地分析了中风回语颗粒所含的化学成分，共鉴定出93 个化学成分，主要有生物碱类、苯丙素类、蒽醌类、酮类、糖酯类等成分，生物碱类成分大多数来自于黄连；蒽醌类成分来自于酒大黄；酮类、糖酯类成分来自于远志。据文献［5，14，16］报道，这些成分具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等药理作用，对缺血性脑中风具有明显的改善作用。这为中风回语颗粒化学成分的定性分析提供了一种快速、高效的分析方法，丰富了该复方的化学成分信息，并为中风回语颗粒活性成分筛选、作用机制探讨、质量控制研究及安全性评价提供了物质基础支持。同时，此思路对中药材及中成药复杂体系的化学成分解析提供了一种方法参考，多种分离技术和LC-MS 技术的结合将有助于进一步扩展LC-MS 方法的鉴别容量与应用范围。