一株多耐药撒坝猪致病性E. coli irp2基因缺失菌株的构建

富国文，敖平星，单春兰，赵 汝，刘超英，高 洪

(云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201)

耶尔森菌强毒力岛(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)首先发现于鼠疫耶尔森氏菌，为其毒力表型所必需，含有与摄铁有关的毒力基因簇[1-2]。进一步的调查发现，HPI不仅存在于耶尔森氏菌，在其他杆菌中也广泛存在，如致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、枸橼酸杆菌、沙门菌、克雷伯菌等，是一个重要的毒力因子[3-5]。irp2是HPI的主要功能基因，近年来一些研究从不同的角度证实了irp2在E.coli致病中的作用，但其致病机制仍未完全明确[6-8]，因此，irp2基因缺失株的构建对其致病机制的研究至关重要。Red同源重组是E.coli基因敲除的常用方法，分别携带氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的pKD46、pKD3/4和pCP20是常用的工程质粒[7-9]。要利用上述抗性进行筛选，就要求试验菌株对这些抗生素具有敏感性。由于抗生素在养殖生产中的广泛使用，很多临床分离菌株对其中的一种或多种抗生素不敏感，给筛选带来困难。E.coliA/10是一株分离自腹泻撒坝仔猪粪便的致病性大肠埃希菌，耐药性检测表明该菌对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、土霉素和壮观霉素不敏感，对卡那霉素和博来霉素敏感。我们期望在Red同源重组方法的基础上进行改进，实现该多耐药菌株的irp2基因缺失。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与质粒E.coliA/10菌株分离自腹泻撒坝仔猪粪便，由云南农业大学动物病理学实验室鉴定，并证实该菌株具有致病性；大肠埃希菌DH5α由本实验室保存。pPICZαA质粒(含博来霉素抗性)和pCas(含卡那霉素抗性)由西北农林科技大学杜恩歧副教授馈赠，pCP20质粒购自淼灵生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 2×Easy TaqPCR Super Mix、DNAMarker，北京百泰克生物有限公司；ApaⅠ、BglII、T4连接酶、核酸染料、琼脂糖、50×TAE，宝生物(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；博莱霉素、卡那霉素，Gibco公司，使用浓度分别为25 mg/L和50 mg/L；LB培养基，广州环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 电穿孔仪(GenePulser Xcell)、PCR仪，伯乐公司；FA1004N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YXQ-SG46-280不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DYCP-31BN电泳仪，北京六一仪器厂；WD-9403F凝胶成像仪，北京六一仪器厂；高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司。

1.1.4 引物设计 根据本实验室已测序的E.coliA/10菌株irp2基因序列设计打靶片段引物arm-F和arm-R(包含同源臂、FRT位点和博来霉素抗性引物)；以pCP20质粒为模板，设计引物FLP-F和FLP-R(分别携带ApaⅠ和BglII酶切位点)扩增FLP酶；以pCas质粒序列为模板，设计鉴定引物pCas-JD-F和pCas-JD-R；以pCP20序列为模板，设计FLP酶鉴定引物FLP-JD-F和FLP-JD-R；以E.coliA/10菌株irp2基因上下游序列为模板设计irp2基因缺失鉴定引物Δirp2-F和Δirp2-R。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物

1.2 方法

1.2.1 打靶片段扩增与重组质粒构建 以arm-F、arm-R为引物，以pPICZαA质粒为模板，扩增打靶片段。PCR反应体系为25 μL：模板DNA 1 μL，上、下游引物各 0. 5 μL，TaqPCR Super Mix为12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；72 ℃延伸5 min。产物1%琼脂糖凝胶电泳，回收，命名为arm，-20 ℃保存备用。

以FLP-F、FLP-R为引物，以pCP20质粒为模板，扩增FLP片段。PCR反应体系同上, 退火温度56 ℃，产物命名为FLP。利用ApaⅠ和BglII酶分别对扩增的FLP片段和pCas质粒进行双酶切。酶切体系：ApaⅠ酶1 μL，BglII酶1 μL，pCas质粒/FLP片段18 μL，Buffer 5 μL，纯水25 μL，混匀，37 ℃水浴2 h。DNA回收试剂盒回收产物，纯水20 μL溶解待用。上述酶切产物，以T4连接酶进行连接。酶连接体系：T4连接酶5 μL，pCas质粒酶切产物1 μL，FLP酶切产物4 μL，16 ℃水浴1 h，DNA回收试剂盒回收产物，纯水20 μL溶解待用。将上述产物电转化至DH5α感受态细胞，方法参见文献[10]，接种于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃过夜培养，挑取单克隆菌落，以FLP-JD-F、FLP-JD-R为引物进行鉴定，PCR反应体系同上。扩增条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。将鉴定为FLP阳性的克隆菌接种于LB液体培养基中30 ℃过夜培养，提取质粒，命名为pCas-FLP，-20 ℃保存备用。

1.2.2 pCas介导的irp2基因缺失 以E.coliA/10制备电转感受态细胞，方法参见文献[10]。将pCas电转化E.coliA/10感受态细胞，接种于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃过夜培养，阳性克隆以pCas-JD-F和pCas-JD-R为引物进行鉴定。扩增条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30个循环；72 ℃延伸5 min。将pCas质粒转化成功的菌株接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，30 ℃、180 r/min培养至OD600为0.2时，向摇瓶中加入终浓度为10 mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas载体上λ-Red蛋白表达，继续摇至OD600为0.5时回收菌体，同上方法制备电转感受态细胞。将arm电转化到含pCas的E.coliA/10感受态细胞中，于含25 mg/L博莱霉素和50 mg/L卡那霉素的LB双抗固体培养基上30 ℃过夜培养。挑取阳性转化子，接种于LB液体培养基中，37 ℃过夜培养，取50 μL菌液用LB液体培养基10倍稀释后涂布于含25 mg/L博莱霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养，挑取单克隆菌落，接种于含有50 mg/L卡那霉素的液体LB中，不能生长表明pCas质粒被消除。

以上述消除pCas质粒的单克隆菌株制备电转感受态细胞，方法参见文献[10]，电转入pCas-FLP重组质粒，于含50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基上30 ℃过夜培养。挑取阳性克隆菌，接种于含有25 mg/L博莱霉素的LB平板，30 ℃过夜培养，不能生长表明打靶片段被去除。同pCas消除步骤消除pCas-FLP重组质粒，获得目的重组菌，以Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R为引物进行鉴定。扩增条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。产物1%琼脂糖凝胶电泳，回收后送昆明擎科生物科技有限公司测序，正确的菌株命名为Δirp2-E.coliA/10。

1.2.3 生长曲线测定 挑取E.coliA/10与 Δirp2-E.coliA/10菌株单克隆接种于LB液体培养基过夜培养，调整吸光度为OD600≈0.5，分别按1∶100的比例接入20 mL的LB培养基中，调OD600≈0.01，150 r/min，37 ℃振荡培养，每隔1 h测定OD600，每个时间点测3个重复，绘制生长曲线。

2 结 果

2.1 打靶片段扩增与重组质粒构建

本试验中用于敲除irp2基因的打靶片段由位于两侧的同源臂、FRT位点和中间的博莱霉素抗性基因组成，大小为840 bp。PCR扩增后，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，与目的片段大小基本一致(图1A)。

以FLP-F 和FLP-R为上下游引物扩增FLP酶序列，两端分别携带ApaⅠ和BglⅡ酶切位点，大小应为2 262 bp。PCR扩增后，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，与目的片段大小基本一致(图1B)。FLP片段和pCas质粒经ApaⅠ和BglⅡ酶切后以T4连接酶连接，电转化至DH5α感受态细胞，于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上长出单克隆菌落。随机挑选单克隆菌，以pCas-JD-F和pCas-JD-R为引物进行PCR检测，扩增到清晰条带，大小为450 bp左右，与目的条带大小基本一致(图1C)，表明pCas-FLP重组质粒构建成功。

图1 打靶片段扩增与重组质粒构建过程中的PCR产物

2.2 pCas介导的irp2基因缺失

转入pCas质粒后的E.coliA/10阳性转化子，以pCas-JD-F和pCas-JD-R为引物进行PCR扩增，产物大小340 bp左右，与目的条带大小基本一致(图2 A)，表明pCas质粒转化成功。继续电转入打靶片段后，在含有卡那霉素和博来霉素的LB平板上有单克隆菌长出，提示打靶片段整合到E.coliA/10基因组。在37 ℃的LB液体培养基中过夜培养后，筛选得到pCas质粒被消除的单克隆菌。

上述消除pCas质粒的单克隆菌电转pCas-FLP后，在卡那霉素平板上长出单克隆菌。随机挑取的单克隆菌在博莱霉素平板上不能生长，提示打靶片段被消除。经37 ℃培养后，获得了不能在卡那霉素平板上生长的单克隆，提示pCas-FLP质粒被消除。以位于同源臂上下游的Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R引物对消除pCas-FLP质粒的单克隆菌株进行PCR扩增，产物大小369 bp左右，符合预期(图2B)。目的条带测序结果证实irp2基因5 990 bp被删除，一个FRT位点被保留，表明irp2基因缺失菌株构建成功，获得目的菌Δirp2-E.coliA/10。

图2 pCas鉴定与E.coli A/10 irp2基因缺失鉴定的PCR产物

2.3 irp2基因缺失对菌株生长的影响

E.coliA/10和Δirp2-E.coliA/10菌株在37 ℃、150 r/ min的LB液体培养基中的生长曲线见图3。亲本株与缺失株在各测试点生长速率差异不显著(P>0.05)，表明irp2基因缺失对该菌株在LB培养基中的增殖没有显著影响。

图3 E. coli A/10与E. coli Δirp2-A/10菌株生长曲线

3 讨 论

随着测序技术的快速发展，越来越多的细菌基因组序列被公布，大量的分子生物学信息被获得，然而对基因功能的了解却很有限，而基因编辑提供了一种了解单个基因功能的途径。从20世纪80年代基因敲除首次被报道，至今已涌现出多种不同的基因编辑技术，广泛应用于微生物学、细胞生物学、分子生物学、食品发酵工程等多个领域[9,11]。1998年，Murphy利用噬菌体Red同源重组系统对大肠埃希菌中进行了基因编辑，通过克隆到质粒上的exo、beta、gam基因协同作用，促进同源重组的发生，大大提高了重组效率，使其广泛应用于E.coli的基因编辑[12-14]。

随着各种抗生素及化学合成药物在养殖生产中的广泛使用，养殖环境中细菌的耐药谱不断扩大，耐药水平不断提升，导致我们对临床分离菌株进行基因编辑时可使用的筛选标记越来越少[15]。在本试验中，分离自腹泻撒坝仔猪粪便的E.coliA/10对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、土霉素和壮观霉素等抗生素不敏感，使得经常用于E.coli的Red同源重组质粒难以实现对该菌株的基因编辑，促使我们探索新的策略。首先以携带卡那霉素抗性的pCas质粒代替pKD46质粒，因为E.coliA/10对卡那霉素敏感，而该质粒上携带的exo、beta、gam为Red同源重组所必须。理论上，此处对pKD46质粒进行改造，将氨苄青霉素抗性替换为卡那霉素抗性应该也是可行的，但需要增加操作环节。其次，因为该菌株对博莱霉素敏感，便于筛选，故以含有博来霉素抗性的pPICZαA质粒为模板扩增打靶片段。

位点特异性重组(site-specific recombination)技术是20世纪80年代发展起来的一项重要分子生物学技术，可通过特异性位点重组酶，在基因组和外源DNA上进行基因操作，实现基因置换、倒置和敲除[16-17]。 Cre/loxp、 FLP/FRT和ΦC31-Int是当前研究和应用最多的位点特异性重组系统。来源于酵母的 FLP/FRT位点特异性重组系统由于具有较高的重组效率和靶向性，已经被广泛应用于细菌、HIV病毒等微生物的基因编辑[18]。在利用Red同源重组进行E.coli基因编辑时，该系统主要用于打靶片段的消除。在进行打靶片段扩增时，将34 bp的FRT位点插入同源臂与抗性基因引物序列之间，需要注意的是，两侧的FRT位点方向要相同，此时两FRT位点之间的基因被删除[19]。在FLP/FRT系统介导的重组反应中，FLP 重组酶是除重组位点外唯一的必需因子。可表达FLP重组酶的pCP20是应用该系统进行E.coli基因编辑时常用的质粒，通常携带氯霉素和氨苄青霉素抗性。由于E.coliA/10对氯霉素和氨苄青霉素不敏感，难以进行筛选，本研究中将pCP20质粒中的氯霉素抗性替换为卡那霉素抗性，未能实现对打靶片段的消除，推测可能是由于该质粒中还含有氨苄青霉素抗性基因，而E.coliA/10具有氨苄青霉素抗性，影响到该质粒的表达，其确切机制有待进一步研究。之后，我们尝试将pCP20质粒中的flp基因克隆出来并连接到pCas质粒，通过pCas质粒来表达FLP重组酶，成功实现了对打靶片段的消除。生长曲线测定结果表明，在LB培养基中irp2基因缺失对菌株的生长无显著影响，这可能与大肠埃希菌还有其他获取铁的方式有关，如肠菌素、沙门菌素、气杆菌素等[20-21]。

4 结 论

本研究以Red同源重组的方法为基础，根据菌株的耐药特点构建针对性的重组质粒，成功实现了对E.coliA/10的基因敲除，为多耐药E.coli的基因编辑提供了一种新的方法。