西林水牛和富钟水牛mtDNA D-loop序列的遗传多样性研究

马晓慧，王自豪，贾 鹏，雷初朝，廖玉英，黄光云*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，广西南宁，530001；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌，712100)

水牛在动物学分类上属于哺乳纲、偶蹄目、牛科、水牛属。水牛属包括非洲水牛亚属和亚洲水牛亚属[1]。现在世界上所有的家养水牛都是由亚洲水牛亚属驯化而来。根据水牛的体型外貌、生活习性、细胞遗传学和分子遗传学等方面的不同，把家养水牛分为两类，即江河型水牛(2n=50)和沼泽型水牛(2n=48)。中国水牛资源丰富，目前有24个沼泽型地方水牛品种，主要分布在中部和南部的18个省，特别在长江流域西南部和东南部的水稻种植区大量分布，在山东临沂、陕西汉中、安康也有分布[2]。西林水牛和富钟水牛是广西壮族自治区重要的水牛品种，具有结构匀称、体格粗壮、四肢强健、性情温驯、役用性能好、耐粗饲、善爬坡、适应性和抗逆性强等特点[2]。

线粒体DNA遵循母系遗传，进化速度快，变异主要来源于突变而非重组，可以真实地反映家畜的母系起源，在家畜的品种起源、遗传分化和亲缘关系等方面得到了广泛应用，是物种鉴定和祖先母系起源研究的最佳标记之一[3]。Lei等[4]通过对中国6个水牛品种30个个体的mtDNA D-loop序列的研究，揭示中国沼泽型水牛由A和B 2个支系组成。Yue等[5]通过研究中国22个沼泽型水牛品种mtDNA D-loop序列的遗传多样性，提出支系A很可能在中国西南地区驯化而来。Zhang等[6]对中国、台湾、越南、老挝、泰国、尼泊尔的沼泽型水牛的mtDNA D-loop序列进行分析，发现沼泽型水牛的遗传多样性高于江河型水牛，沼泽型水牛遗传多样性最高的地区是湄公河两岸南部和印度支那北部，提出中国西南部与印度支那边界地区是沼泽型水牛的驯化地。

本研究旨在通过分析西林水牛和富钟水牛的mtDNA D-loop全序列，以确定西林水牛和富钟水牛的遗传多样性及母系起源，为其遗传资源保护、开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与数据来源

采集广西的西林水牛和富钟水牛各30个个体的耳组织样品，用75%乙醇保存带回实验室，-80 ℃超低温保存。同时，从NCBI数据库下载25条已公布的西林水牛和富钟水牛的mtDNA D-loop序列。

1.2 基因组DNA提取、PCR扩增与测序

采用酚-氯仿法提取基因组DNA，采用Kierstein[7]设计的引物扩增水牛mtDNA D-loop全序列。正链引物和反链引物分别为：F: 5'-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3'; R: 5'-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3'。PCR反应体系总体积为12.5 μL，扩增程序为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将PCR产物送西安生工生物工程有限公司进行纯化与测序。

1.3 数据处理与统计分析方法

测序结果用Lasergene Seqman7.10软件进行同源序列比对并进行人工校对，以确保其准确性。用DNASP 5.10[8]软件统计单倍型数量、单倍型多样度、核苷酸多样度、核苷酸多态位点等。用MEGA7.0[9]构建水牛的NJ系统发育树。

2 结果与分析

2.1 西林水牛和富钟水牛mtDNA D-loop区遗传多样性

对50头西林水牛和35头富钟水牛的mtDNA D-loop全序列进行分析，其mtDNA D-loop全序列由A、T、C、G四种碱基组成，其中A碱基含量最高，为31.0%，其次为T和C碱基，分别为27.7%和26.3%，G碱基含量最少(15.0%)，A+T平均含量为58.7%，G+C平均含量为41.3%，A+T平均含量明显高于G+C平均含量，表现出碱基的偏好性。

50头西林水牛的mtDNA D-loop序列的单倍型多样度为0.909±0.028，核苷酸多样度为0.019±0.004；35头富钟水牛的mtDNA D-loop单倍型多样度为0.913±0.035，核苷酸多样度为0.013±0.005，说明西林水牛和富钟水牛具有丰富的遗传多样性。

在50头西林水牛和35头富钟水牛的mtDNA D-loop全序列中，共检测到60个多态位点，包括57个转换和3个颠换，其中C/T转换有32个，A/G转换有25个。这60个多态位点共定义38种单倍型(图1)，其单倍型多样度为0.917±0.022，核苷酸多样度为0.017±0.004。

2.2 西林水牛和富钟水牛的NJ系统发育树

以一条黄牛(登录号：AB177796)和一条江河型水牛(登录号：EU268883)的mtDNA D-loop序列作为外群，用MEGA7.0软件构建西林水牛与富钟水牛38个mtDNA D-loop单倍型的NJ系统发育树(图2)。从NJ系统发育树的聚类可以看出，这85头水牛都为沼泽型水牛，且38个mtDNA D-loop单倍型明显分为A、B两大支系，A支系包括25个单倍型，代表61头水牛，占71.76%(61/85)，B支系包括13个单倍型，代表24头水牛，占28.24%(24/85)，说明西林水牛和富钟水牛有A和B支系2个母系起源，但B支系的单倍型变异程度(54.17%，13/24)比A支系(40.98%，25/61)高。

图1 富钟与西林水牛38个mtDNA D-loop单倍型的多态位点

图2 富钟与西林水牛38个mtDNA D-loop单倍型的NJ树

3 讨 论

通过分析85头富钟与西林水牛mtDNA D-loop序列，发现其四种碱基A、T、G、C的含量分别为31.0%、27.7%、15.0%、26.3%，表现出碱基的偏好性，这是多细胞动物mtDNA D-loop序列的显著特征[10]。A+T的平均含量为58.8%，G+C的平均含量为41.3%，显然A+T的平均含量高于G+C的平均含量，而在山羊[11]、绵羊[12]、牦牛[13]、猪[14]、鸡等[15]动物mtDNA D-loop区的研究结果也表明，mtDNA D-loop区的A+T的平均含量高于G+C的平均含量，说明动物mtDNA D-loop区的核苷酸含量在物种间有一定的相似性。本研究共检测到60个变异位点，转换有57个(占95%)，其中包含32个C/T 转换，25个A/G 转换；颠换有3个(占5%)，这一结果也符合哺乳动物 mtDNA 进化的特点[10]。单倍型多样度和核苷酸多样度是衡量群体遗传变异的一个重要指标，单倍型多样度和核苷酸多样度的值越大，说明群体的遗传多样性越丰富，反之，则说明群体的遗传多样性越低。前人已经有了大量关于水牛遗传多样性的研究，齐国强等[16]报道中国10个沼泽水牛群体的mtDNA D-loop序列的平均单倍型多样度为0.8952±0.0240，平均核苷酸多样度为0.0200±0.0056，表明了中国水牛的遗传多态性丰富。谢文美等[17]计算出中国21个水牛群体mtDNA D-loop序列的平均单倍型多样度和核苷酸多样度分别为0.8460±0.0240和0.01403±0.00178，张自芳等[18]通过对滇东南水牛的研究得到其单倍型多样度为0. 815±0. 066，核苷酸多样度为0.01134±0.00306。本研究中，50头西林水牛的单倍型多样度为0.909±0.028，核苷酸多样度为0.019±0.004，35头富钟水牛的mtDNA D-loop区单倍型多样度为0.913±0.035，核苷酸多样度为0.013±0.005。与前人研究相比，西林水牛和富钟水牛的遗传变异均高于中国水牛的平均水平，说明西林水牛和富钟水牛具有丰富的遗传多样性。本研究的NJ系统发育树显示西林水牛和富钟水牛聚为A支系和B支系，说明这两个水牛品种有A支系和B支系两个母系起源，与Lei等[19-20]所发现的中国水牛有两个母系起源的观点一致。西林水牛和富钟水牛的A支系占71.76%，为主要支系，B支系占28.24%，为次要支系，但B支系的单倍型变异程度(54.17%)比A支系(40.98%)高，这与谢文美等[21]及Zhang等[6]分别对涪陵水牛和中国水牛mtDNA的研究结果一致，说明A支系水牛群体中的基因交流较B支系更频繁。从mtDNA D-loop序列的研究结果来看，西林水牛与富钟水牛的遗传多样性丰富，也没有受到江河型水牛，如摩拉水牛和尼里拉菲水牛杂交改良的影响，且这2个品种的遗传结构类似，建议广西壮族自治区畜牧相关部门选择其中1个水牛品种进行遗传资源保护，另1个品种可以开发利用。