USP47通过促进抗凋亡蛋白表达介导头颈鳞癌细胞顺铂耐药

童 桐，秦 星，谢 非，蒋英英，石剑波，张建军

上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面头颈-肿瘤科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011

头颈部恶性肿瘤患者的病死率较高，其中90%属于鳞状细胞癌［1］，简称头颈鳞癌（head and neck squamous cells carcinoma，HNSCC）。尽管有许多针对HNSCC 的新疗法，但“手术+化学治疗（化疗）+放射治疗（化疗）”的三联疗法仍是治疗HNSCC 的主要方法［2-3］。顺铂（cisplatin，DDP） 是治疗HNSCC 常用的化疗药物之一［4］。许多患者在DDP 治疗的早期阶段获得了良好的效果，但会随着时间的推移而发生耐药［4］。研究［5］结果表明，超过70%的HNSCC 患者因为对DDP 产生耐药而导致疾病复发。因此，了解DDP 耐药的潜在机制并制定有效的抵抗DDP的耐药策略是临床上需要解决的问题。

泛素化是主要的蛋白翻译后修饰方式之一，在调节细胞的生长、分化和凋亡等过程中起着至关重要的作用［6］。泛素化是可逆的，主要通过去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUB）从底物蛋白上裂解泛素，编辑泛素链并加工泛素前体［6-7］。DUB作为E3泛素连接酶的拮抗剂，是泛素-蛋白酶体系统的组成部分［8］。根据序列和结构域保守性，DUB 分为6 个家族：泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitinspecific proteases，USPs）、泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCHs）、Joesphin结构域蛋白家族（Machado-Josephin domain-containing proteases，MJDs）、卵巢肿瘤蛋白酶家族（ovarian tumour proteases，OTUs）、与含泛素的新型DUB家族相互作用的基序（motif-interacting with ubiquitin-containing novel DUB family，MINDYs）和JAMM 家族（JAB1、MPN、MOV34 family）［7，9］。其中，USPs是数量最多的一类DUB［10］，并在各种生物学过程中起着重要作用。

去 泛 素 化 酶47 （ubiquitin specific peptidase 47，USP47）是USPs的成员之一［7-8］，在调节细胞活力和维持基因组完整性方面发挥关键作用［10-11］。USP47 可以促进肺癌和前列腺癌细胞Wnt 信号通路的活化［11］，也可以调控结直肠癌细胞的上皮-间充质转化［12］。在胃癌中，USP47 还被证实可以增强癌细胞的化疗耐药性和生存能力，并且被认为是一种新的治疗靶标［8］。但是，关于USP47 在HNSCC 发病进展和治疗过程中发挥的作用，尚无文献报道。因此，本研究通过构建人HNSCC的DDP耐药细胞株，探索USP47 与HNSCC 的DDP 耐药之间的关系及潜在的机制，为逆转DDP耐药的临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖DMEM 培养基（源培，中国），10%胎牛血清（CellMax，中国），DDP 注射液（豪森药业，中国），PrimeScriptTMRT reagent Kit （TaKaRa，日本），SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa，日本），LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（Invitrogen，美国），4%～20%SurePAGE 蛋白预制胶（GenScript，中国），鼠单克隆GAPDH抗体（Proteintech，美国；1∶10 000），鼠单克隆USP47抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国；1∶500），兔多克隆重组人B 细胞淋巴瘤因子2 xL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma 2 xL，Bcl-xL）抗体（ABclonal，中国；1∶2 000），兔多克隆X-连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）抗体（Proteintech，美国；1∶2 000），鼠单克隆Ubiquitin抗体（CST，美国；1∶2 000），荧光二抗（LI-COR Biosciences，美国；1∶10 000），MTT（Sigma，美国），Annexin V FITC Apop Dtec Kit I 100Tst（BD Pharmingen，美国），Protein A/G免疫沉淀磁珠（Bimake，美国），MG132（Selleck，美国）。

1.2 细胞培养

人HNSCC 细胞系WSU-HN4 （HN4）、WSU-HN30（HN30）由美国马里兰大学牙医学院赠送。HN4、HN30细胞均用高糖DMEM 培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100µg/mL）培养，放置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。

1.3 DDP耐药株构建

采用浓度逐步递增法构建人HNSCC细胞的DDP耐药株，DDP浓度依次为5、7.5、10、15、20 μmol/L。具体操作方法是在细胞传代时向培养基中加入终浓度为5 μmol/L的DDP，连续传代培养至细胞可以在此DDP浓度的培养基中稳定生长。再按前文所述的浓度梯度增加DDP剂量。将耐受DDP的HN4和HN30细胞株分别命名为HN4/DDP和HN30/DDP。

1.4 USP47基因过表达细胞株的构建

采用慢病毒感染法构建USP47 基因过表达细胞株（USP47 基因过表达及对照慢病毒均购于上海汉尹公司）。细胞用胰酶消化、计数后，重悬成单细胞悬液并接种至6 孔板，以24 h 后贴壁细胞密度为20%～30%为宜；待细胞密度为40% 左右，根据感染复数（multiplicity of infection，MOI）值计算加入病毒悬液的体积，同时加入聚凝胺（终浓度为10 μg/mL）摇匀；72 h后用含10 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，连续培养1 个月后进行相应实验。USP47 基因过表达和对照组细胞分别命名为USP47 和Vector。

1.5 USP47基因敲除细胞株构建

采用慢病毒感染法构建USP47 基因敲除细胞株（敲除对照慢病毒及敲除慢病毒购于上海汉尹公司），USP47基因敲除组和对照组细胞分别命名为KO USP47 和KO NC。具体步骤见“1.4”。

1.6 小干扰RNA转染

使用XIAP 和Bcl-xL 基因各自特异的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA） 序列（Genomeditech，中国）分别敲减USP47 基因过表达细胞中XIAP mRNA 和Bcl-xL mRNA 的 表 达。 使 用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent进行siRNA 的转染。细胞接种至6 孔板中，以贴壁后细胞密度为30%～40%为宜；转染前，换双无培养基；按照每孔siRNA 终浓度为50 pmol/L 的量进行转染。XIAP和Bcl-xL基因特异的siRNA序列见表1。

表1 XIAP和Bcl-xL基因特异的siRNA序列Tab 1 siRNA sequences specific for XIAP and Bcl-xL genes

1.7 MTT法检测细胞DDP半数抑制浓度

细胞的DDP 半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）主要通过MTT 法进行检测。将处于指数生长期的细胞用胰酶消化、计数后，重悬成单细胞悬液，并接种至96孔板中，每孔100 μL，细胞数为3 000个；以相同体积培养基孔为空白对照；设置10 个DDP 浓度梯度，每个浓度设置3个复孔；放入培养箱中常规培养24 h后，将正常培养基换成含有DDP 的培养基；72 h 后，向每孔中加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，小心弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，避光摇匀；用酶标仪检测490 nm 波长下各孔的吸光度［D （490 nm）］。利用Graphpad prism 7软件计算IC50。

1.8 免疫印迹实验

用全细胞裂解液提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度；取蛋白裂解产物（40 μg/孔）置于4%～20%SurePAGE 蛋白预制胶中进行电泳；电泳结束后，再用90 V恒压电转；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入USP47（1∶500）、GAPDH（1∶10 000）、XIAP（1∶2 000）、Bcl-xL（1∶2 000）抗体，4 ℃孵育过夜；PBST洗涤3次，10 min/次；加入与一抗相同种属的二抗，室温孵育1 h，PBST洗涤3次后，显影观察。

1.9 实时定量PCR

提取细胞总RNA，使用PrimerScript RT 试剂盒将提取的总RNA 反转录成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行所有实时定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）反应。每组设置3 个复孔，使用β-actin 作为内参基因。运用△△CT法分析实验数据，从而得到目的基因在样本中的相对表达量。用Primer Premier 5软件设计引物序列，由上海生工生物股份有限公司合成，具体序列见表2。

表2 RT-PCR引物序列Tab 2 RT-PCR primer sequences

1.10 细胞增殖实验

将细胞以每孔100 μL、1 000 个细胞的密度接种到96 孔板上，每组设3 复孔。细胞增殖测定采用MTT 法。每天向每组的3个复孔中加入10 μL MTT，培养箱中静置4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光摇匀，用酶标仪检测D（490 nm）。

1.11 细胞平板克隆形成实验

将细胞接种到6 孔板中（每孔约500 个细胞），置于培养箱中培养8～15 d，直至形成可见的克隆。PBS 洗涤2～3 次，用4%多聚甲醛固定30 min，并用0.1%结晶紫染色30 min。染色后，洗涤、风干、拍照。

1.12 细胞凋亡检测

采用流式细胞术检测细胞的凋亡比例。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS 洗涤细胞2 次（5 000×g，4 ℃离心5 min），加入1×结合缓冲换液重悬，300×g，4 ℃离心10 min，弃上清，加入Annexin V和PI（1×结合缓冲换液=1∶50），混匀、冰上避光反应15 min；加入400 μL 1×结合缓冲换液重悬，转移至流式管中，立即进行检测。

1.13 泛素化测定

提取细胞总蛋白并稀释至蛋白质量浓度为2 μg/μL，取30 μL样品留作对照Input。将上述稀释好的蛋白样品等分成2份（每份蛋白总量至少1 mg），用RIPA裂解液稀释5倍；向稀释好的2份样品中各加入70 μL 蛋白A/G免疫磁珠，4 ℃旋转30 min后，1 000×g离心1 min取上清；将上清等分为2份，一份加入目的抗体，一份加入等体积的同种属的IgG抗体，4 ℃旋转过夜；第2日，向两份样品中各加入60 μL蛋白A/G免疫磁珠，室温旋转4 h，1 000×g 离心1 min，弃液取沉淀；沉淀用洗杂液反复漂洗5次后加入60 μL 1×上样缓冲液，105 ℃金属浴煮10 min。实验所得样品进行后续的免疫印迹实验。

1.14 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。2 组之间比较采用独立样本t 检验，3 组及3 组以上的比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNSCC细胞DDP耐药株的构建

以HN4 和HN30 为亲本细胞，采用梯度增加DDP 浓度的方法构建DDP 耐药株HN4/DDP 和HN30/DDP。6 个月后，DDP 处理浓度达到20 μmol/L。利用MTT 法分别检测DDP 对亲本细胞和耐药细胞的IC50。亲本细胞HN4的IC50为6.62 μmol/L，而 耐 药 细 胞HN4/DDP 的IC50为49.56 μmol/L（为HN4的7.49倍）；亲本细胞HN30的IC50为4.37 μmol/L， 而 耐 药 细 胞HN30/DDP 的IC50为42.14 μmol/L（为HN30的9.64倍）（图1A）。为了进一步验证耐药性的持续能力，将HN4/DDP 和HN30/DDP 在正常培养基中培养48 h 后，检测各自的IC50。结果显示：HN4/DDP 的IC50仍高达36.74 μmol/L，而HN30/DDP 的IC50也达到34.98 μmol/L（图1B）。

2.2 DDP耐药株中USP47蛋白表达的变化

通过免疫印迹实验检测HN4、HN30、HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白的表达水平。结果显示，与亲本细胞相比，HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白表达水平显著上调（图2），且表达量与DDP耐受浓度呈正相关。

图1 DDP耐药HNSCC细胞株的构建Fig 1 Construction of DDP-resistant strains of HNSCC

图2 DDP耐药细胞株HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白的表达Fig 2 USP47 protein expressions in DDP-resistant HN4/DDP and HN30/DDP cell lines

2.3 USP47基因过表达对HNSCC细胞DDP耐药性的影响

免疫印迹实验及RT-PCR 结果显示，USP47 基因过表达稳转细胞株构建成功（图3A、3B）。运用MTT 法检测DDP对USP47基因过表达稳转细胞株的IC50（图3C），结果发现过表达USP47 基因后，DDP 对HN4 细胞的IC50由2.98 μmol/L 升至12.34 μmol/L，而DDP 对HN30 细胞的IC50由3.76 μmol/L升至7.41 μmol/L。

2.4 敲除USP47 基因提高HNSCC 细胞对DDP 的敏感性

RT-PCR 和免疫印迹实验检测USP47 的敲除效率，结果表明HN4/DDP 和HN30/DDP 中USP47 的蛋白及mRNA表达水平显著下降，差异具有统计学意义（图4A、4B）。通过MTT 法检测DDP 对处理组和对照组细胞的IC50，发现敲除USP47 基因后，耐药株HN4/DDP 和HN30/DDP 的IC50均 下 降；HN4/DDP 细 胞 的IC50由39 μmol/L 降 至26.02 μmol/L，而HN30/DDP 细胞的IC50由33.45 μmol/L降至20.26 μmol/L（图4C）。

2.5 过表达USP47 对HNSCC 细胞增殖、克隆形成及凋亡的影响

细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示，过表达USP47后，HNSCC细胞的增殖能力显著减弱（图5A），克隆形成能力也下降（图5B）。通过流式细胞技术检测过表达USP47 后HNSCC 细胞的凋亡变化，结果发现，过表达USP47 后，HN4 和HN30 的基础凋亡率与对照组相比无明显改变（图5C）；而在DDP的作用下，过表达USP47的HN4和HN30 细胞，其凋亡率出现明显下降（图5D）。

图3 USP47基因过表达增强HNSCC细胞对DDP的抵抗能力Fig 3 Overexpression USP47 gene increases cell′s resistance to DDP

图4 敲除USP47基因逆转HNSCC细胞对DDP的耐药Fig 4 Knocking out USP47 gene reverses cell′s resistance to DDP

图5 过表达USP47对HNSCC细胞的增殖、克隆形成和凋亡的影响Fig 5 Effect of USP47 gene overexpression on cell proliferation,colony formation and apoptosis

2.6 过表达USP47促进抗凋亡蛋白的表达

免疫印迹实验结果显示，在HN4 和HN30 细胞中过表达USP47后，抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL表达水平均显著升高（图6A）；相应地，敲除HN4/DDP 和HN30/DDP细胞中USP47 基因后，XIAP 和Bcl-xL 的表达水平则明显下降（图6B）。进一步的泛素化实验结果显示，敲除USP47 后，XIAP 和Bcl-xL 蛋白的泛素化水平升高，蛋白自身表达水平下降（图6C）；而在抑制泛素化蛋白的降解“场所”——蛋白酶体的活性后，XIAP 和Bcl-xL 的表达水平相比对照组明显升高（图6D）。

案例12：立体几何引言容易上得平淡无味，可由下列活动导入：大家动手试一试用3支铅笔看能摆出几个直角？用6支新铅笔又能摆出几个以他们为边的正三角形？

2.7 抗凋亡蛋白表达下调阻断USP47 基因过表达诱导的DDP耐药性

在USP47 基因过表达稳转细胞中，利用siRNA 技术降低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的表达量，观察DDP 对其IC50的影响，结果显示（图7）：HN4 USP47 对照组细胞（HN4 USP47+si NC） 的DDP IC50为12.09 μmol/L，而实验组细胞（HN4 USP47+si XIAP 和HN4 USP47+si Bcl-xL）的DDP IC50分别为2.80 和3.71 μmol/L； HN30 USP47 对照组细胞（HN30 USP47+si NC）的DDP IC50为7.41 μmol/L，而实验组细胞（HN30 USP47+si XIAP 和HN30 USP47+si Bcl-xL）的DDP IC50分 别 为3.25 和3.80 μmol/L。抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 表达降低阻断了USP47 基因过表达诱导的DDP 耐药性。

图6 免疫印迹实验检测USP47过表达对抗凋亡蛋白表达的影响Fig 6 Effect of USP47 overexpression on expression of anti-apoptotic proteins by Western blotting

图7 抗凋亡蛋白表达下调阻断USP47基因过表达诱导的DDP耐药性Fig 7 Down-regulation of anti-apoptotic protein blocks DDP resistance induced by overexpression of USP47 gene

3 讨论

大多数耐药株的诱导方式是反复间歇性给予高浓度药物。在本研究中，若一开始即使用高浓度的DDP 刺激细胞，会导致细胞大量死亡，很难诱导成耐药株。因此，本研究采用渐进式升高DDP 浓度的方法，并且每一个浓度都至少传代3次，以保证提高浓度时大部分细胞可以很好地生存。整个诱导周期在6 个月左右。采用MTT 法检测DDP对HNSCC细胞的IC50，判断DDP耐药株的诱导情况。诱导成功的2个细胞株均在正常培养基中培养，经检测，2个细胞株对DDP的耐药性是稳定的。

DDP 作为治疗肿瘤的一线药物，由于内源或获得性的耐药性而严重限制了其在临床中的使用，也因此导致了HNSCC患者总体预后较差。针对DDP耐药性分子机制的研究较多，例如药物积累的减少、DNA 损伤修复的增加、凋亡信号通路的抑制等。研究［8，13］表明，去泛素化酶在参与转移及凋亡途径中发挥调节作用，因而被认为是癌症治疗中有希望的新型药物靶标。

在本研究中，我们发现HNSCC 耐药细胞中去泛素化酶USP47 表达量升高，且与DDP 耐受浓度呈正相关。本研究证实了USP47 可以提高DDP 对HNSCC 细胞的IC50，而抑制USP47的表达可以降低IC50。同时，本研究还发现USP47 过表达会抑制细胞的凋亡，同时抑制细胞的增殖和克隆形成能力。机制研究显示，USP47 基因过表达可以显著提高抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL的蛋白表达量；泛素化测定实验证实了USP47 基因通过降低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的泛素化水平导致其表达量升高；敲低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的表达明显阻断了USP47 基因过表达诱导的DDP耐药性。

XIAP是已知的功能强大的调控凋亡的蛋白［14］，可以直接抑制半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases） 家族的活性［15-16］。XIAP 在大多数肿瘤细胞中过表达，其表达水平与肿瘤的恶性进展、复发、预后以及肿瘤化疗耐药密切相关［17］。Bcl-xL 蛋白属于Bcl-2 家族，位于线粒体外膜上，通常与Bcl-2形成同源二聚体抑制细胞凋亡［18］。有研究［19-20］表明，在DDP耐药的肿瘤细胞中检测到Bcl-xL的表达显著升高。本研究结果证实了XIAP和Bcl-xL 是去泛素化酶USP47 的潜在底物；USP47 通过降低XIAP 和BclxL 蛋白的泛素化修饰水平，提高二者的蛋白表达水平，从而发挥促进HNSCC细胞化疗耐药的生物学效应。

综上所述，USP47 过表达可以抑制HNSCC 细胞的增殖和克隆形成，通过降低抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL的泛素化水平导致其表达量升高进而抑制细胞凋亡，提高HNSCC细胞的DDP耐药性。该研究结果提示USP47可能有望成为治疗HNSCC 的潜在靶基因，探讨其作用机制可为DDP耐药的临床研究提供新思路。

参·考·文·献

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