FBXO22 调控凋亡诱导因子的分子机制及其在肿瘤细胞凋亡中的作用

刘朦迪，潘漪莲，朱晓娜，杨 烁，杨 茜，余 韵

1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院分子医学中心，上海200025；2. 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院生殖遗传科，上海200030；3.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院产科，上海200030

泛素化是一种由激活酶E1、结合酶E2 和连接酶E3构成的酶促级联反应，可与蛋白酶体组成泛素-蛋白酶体系统介导真核细胞内约80%的蛋白质降解或功能改变，其中连接酶E3 负责特异性识别及结合底物［1-2］。SKP1-CUL1-F-box（SCF）复合体是真核细胞中研究最多的E3连接酶，由支架蛋白CUL1、RING 型锌指蛋白、衔接蛋白S-期激酶关联蛋白1（S-phase kinase associated protein 1，SKP1）和底物招募蛋白F-box组成［3］。

F-box蛋白有2个重要的结构域，即F-box结构域和底物结合结构域；F-box蛋白可通过F-box结构域与SKP1相连，进而与CUL1、RING 等结合形成SCF 复合体。72 个F-box 家族成员根据底物结合结构域的特征被分为W、L和O 共3 个亚家族［4］。F-box 蛋白22（F-box only protein 22，FBXO22）作为O 亚家族的成员之一，其基因最早被发现是抑癌基因TP53 的靶基因［5］；同时，FBXO22 可与甲基化P53、去甲基化酶4A形成三元复合体以调控细胞衰老［6］。近年来围绕FBXO22 在肿瘤中作用的研究表明：FBXO22 可通过降解类Krüppel 因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）促进肝癌细胞增殖［7］；通过调控不同底物，促进乳腺癌的生长或抑制其转移［8-9］；通过抑制基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的活性，降解转录因子BACH1（BTB and CNC homology 1），抑制肾癌细胞、肺癌细胞的转移［10-11］；且本实验室前期研究发现，FBXO22 可 分 别 通 过 肝 激 酶B1 （liver kinase B1，LKB1）［12］、 抑 癌 蛋 白PTEN （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）［13］促进肺癌细胞、结直肠癌细胞的增殖。综上所述，FBXO22能够在多种肿瘤的发生与发展中发挥促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移等作用，具有重要的临床研究意义。

凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）是位于线粒体内外膜间隙的一类黄素蛋白，可在烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）损伤、氧化应激下激活多聚ADP-核糖聚合酶PARP-1，导致多聚ADP-核糖PAR 累积，进而促进AIF从线粒体释放入核，并引起染色质凝集和DNA 大片段化，从而诱导细胞凋亡［14-18］。

目前相关研究［19-20］显示，E3 连接酶X 连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）仅能够影响AIF的活性，不能调控AIF水平。基于此，本研究通过挖掘FBXO22 的新底物，探讨其调控底物的分子作用机制，并研究该调控在结肠肿瘤细胞凋亡过程中的作用，以期为肿瘤的临床治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂与仪器

HEK293T 细胞，肺癌细胞株A549，结肠癌细胞株SW480、SW620，结直肠癌细胞株HCT116 以及前列腺癌细胞株PC3（购自中国科学院上海细胞库），Fbxo22 野生型（Fbxo22+/+）和敲除型（Fbxo22−/−）小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）（由本课题组前期构建并保存）。FBXO22抗体（Proteintech Group，美国），AIF抗体（Abcam，美国），CUL1 抗体、SKP1 抗体、XIAP 抗体、β 肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶标记的鼠源或兔源免疫球蛋白抗体（CST，美国），血凝素（hemagglutinin，HA）标签抗体、偶联Flag抗体的M2亲和琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），DMEM培养基、RPMI-1640培养基（Gibco，美国），凋亡试剂盒（eBioscience，美国），Lipo2000（Invitrogen，美国），KOD DNA 聚合酶（Toyobo，日本），T4 连接酶（Promega，美国）。电泳仪、PCR 仪（Bio-Rad，美国），流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）。

1.2 细胞培养

HEK293T细胞、A549细胞、PC3细胞和MEF细胞使用含10%FBS 的DMEM 培养基进行培养，SW480 细胞、SW620 细胞和HCT116 细胞使用含10%FBS 的RPMI-1640培养基进行培养。培养条件为37 ℃、5%CO2。

1.3 表达型质粒及短发卡RNA质粒的构建和细胞转染

表达型质粒构建：将扩增的FBXO22 全长和缺失Fbox 结构域（ΔF）的编码序列（coding sequence，CDS）分别插入PBABE-Flag 载体构建带标签的PBABE-Flag-FBXO22和PBABE-Flag-FBXO22-ΔF 表达质粒，再将其二者分别插入PLVX-ZSGreen 载体构建无标签的PLVXZSGreen-FBXO22 和PLVX-ZSGreen-FBXO22-ΔF 表 达 质粒；将扩增的AIF、CUL1 的全长CDS 序列分别插入PBABE-Flag 载体，构建带标签的PBABE-Flag-AIF 和PBABE-Flag-CUL1 表达质粒；将AIF 的全长CDS 序列插入PCDNA3.0 载体，构建PCDNA3.0-AIF 表达质粒；将扩增的ubiquitin的全长CDS序列插入PCDNA3.0-HA 载体构建PCDNA3.0-HA-ubiquitin 表达质粒。未插入CDS 的PBABE-Flag 为 空 载 体（empty vector， EV）， 记 为PBABE-Flag-EV。

短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）质粒构建：分别将特异靶向FBXO22 或XIAP 的shRNA 片段与线性化pSIREN Retro-Q 载体连接，构建沉默特定基因的敲除质粒（具体步骤参照T4 连接酶说明书）。特异靶向shRNA 片段的序列包括：shFBXO22#1，GTGTGGTCCTTGTCTTT GGTT；shFBXO22#2，CGCATCTTACCACATACAGTT；shFBXO22#3，CCCAAACAATGCCAAGTCCTT；shXIAP，AGATATCTGGGAGCAACTATA。同时，使用无靶向效应的序列插入到pSIREN Retro-Q载体构建阴性对照shNC。

向培养皿中接种处于对数生长期的HEK293T 细胞，待其生长融合度达50%～60%时行转染实验，具体步骤参照Lipo2000转染试剂说明书进行。

1.4 免疫沉淀联合质谱分析

分别向HEK293T 细胞转染带标签的PBABE-Flag-EV（Control组）和PBABE-Flag-FBXO22表达质粒（FBXO22组）24 h，收集HEK293T细胞并向其中加入1×RIPA细胞裂解液（含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1%NP40、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、1×蛋白酶抑制剂的混合液）进行裂解，而后于4 ℃、17 000×g离心10 min去除细胞碎片，获得全细胞裂解液。将其与M2琼脂糖珠孵育行免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）。随后，使用PBST缓冲液［含0.1%吐温的1×磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）］洗涤M2珠3次。收集M2珠，并向其中加入1×SDS裂解液，于100 ℃下变性分离免疫沉淀复合物与M2珠。最后，将获得的免疫复合物经SDS-PAGE凝胶电泳后，使用考马斯亮蓝染液进行染色，扫描仪成像后送至质谱平台对上述2组的差异条带进行鉴定分析，寻找FBXO22的相互作用蛋白。以检测到过表达组中FBXO22自身的肽段数目，及已知的与FBXO22相互作用蛋白SKP1、CUL1和RBX1的肽段数目作为判断IP的成败标准。

1.5 变性条件下泛素化修饰实验

分 别 向HEK293T 细 胞 转 染Flag-AIF、 FBXO22、FBXO22-ΔF 以及HA-ubiquitin 表达质粒24 h 后，收取细胞沉淀。向其中加入适量1×SDS 裂解液进行细胞裂解，并于100 ℃进行蛋白变性以去除蛋白与蛋白间的非特异性结合。经17 000×g 离心10 min 去除不溶沉淀后，取上清液并向其中加入1×RIPA 细胞裂解液，以稀释至SDS 终浓度为0.1% 后与M2 珠孵育行后续IP，检测过表达FBXO22或FBXO22-ΔF对AIF泛素化水平的影响。

1.6 蛋白质印迹检测

向HEK293T 细 胞 转染FBXO22 或FBXO22-ΔF 构建FBXO22 过表达细胞株（PLVX-ZSGreen-FBXO22/ΔF 为实验组，PLVX-ZSGreen-EV 为对照组），分别向HEK293T细胞、MFE 细胞、SW620 细胞、HCT116 细胞和PC3 细胞 转 染shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 构 建FBXO22 敲 低 的 细 胞 株（shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 为实验组，shNC 为对照组），分别向A549细胞转染shFBXO22#1、shXIAP 构建FBXO22、XIAP 敲低的细胞株（shFBXO22#1、shXIAP 为实验组，shNC 为对照组）。培养并收集上述构建好的细胞，向其中加入1×SDS 裂解液进行细胞裂解，于100 ℃进行蛋白变性，经SDS-PAGE后采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭1 h 后加入FBXO22 和AIF 抗体于4 ℃过夜。次日，经PBS 洗涤后，向其中加入相应辣根过氧化物酶标记的鼠源或兔源免疫球蛋白抗，室温孵育1 h。洗膜后进行化学发光显影，检测过表达或敲低FBXO22对AIF蛋白水平的影响。

1.7 细胞凋亡检测

向SW480 细胞分别转染shNC、shFBXO22#1 和shFBXO22#2 构建FBXO22 敲低的细胞株（shFBXO22#1、shFBXO22#2 为实验组，shNC 为对照组）；分别向SW480、 SW620 细 胞 转 染PLVX-ZSGreen-FBXO22 或PLVX-ZSGreen-EV，构建FBXO22 过表达的细胞株（其中PLVX-ZSGreen-FBXO22 为实验组、PLVX-ZSGreen-EV为对照组）。将构建完成的SW480 细胞或SW620 细胞分别按照2×105个或5×105个接种于12 孔板中，培养24 h 后加入500 μmol/L MNNG 处理15 min，而后换正常的完全培养基继续培养24 h（记为MNNG 处理组）；或加入1 mmol/L H2O2继续培养12 h（记为H2O2处理组）；或加入PBS后同MNNG、H2O2步骤处理（记为PBS组）。待观察到处理组细胞出现明显凋亡时收集所有细胞，于2 000×g离心5 min 收集细胞沉淀，按照凋亡试剂盒说明书进行标记处理， 制备好待测样品后于0.5 h 内使用BD LSRFortessa流式细胞仪进行细胞凋亡的检测与分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件对实验数据进行统计分析。定量资料以±s 表示，组间两两比较使用Student's t 检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FBXO22相互作用蛋白的鉴定

本研究采用IP 联合质谱分析技术寻找与FBXO22 相互作用的蛋白，结果（图1）显示免疫沉淀复合物中Flag-FBXO22 被明显富集。将Control 组和FBXO22 组进一步行质谱鉴定分析差异蛋白，结果（表1）显示过表达组中检测到的与FBXO22 相互作用的SKP1、CUL1 及RBX1 蛋白（已报道的）匹配的肽段数分别为327、76 和11个，对照组中均为0，提示IP成功；过表达组检测到的AIF的肽段数为9，对照组为0，提示FBXO22与AIF存在特异性结合。

图1 SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色检测2组免疫沉淀复合物Fig 1 Immunoprecipitation complexes of the two groups detected by SDS-PAGE and Coomassie bright blue staining

表1 质谱鉴定2组差异蛋白的肽段数Tab 1 Different protein peptide number of the two groups detected by IP/MS technology

2.2 IP 检测FBXO22 与AIF 的相互作用及其 对AIF 泛素化水平的影响

本研究向HEK293T 细胞转染相应质粒24 h 后，收集细胞沉淀进行IP，结果（图2A）显示Flag-FBXO22 与内源性AIF 存在相互作用。共表达Flag-AIF 与FBXO22/FBXO22-ΔF 的双外源IP 实验（图2B、2C）显示，Flag-AIF 与FBXO22、FBXO22-ΔF 均存在相互作用，提示AIF与FBXO22 存在相互作用且该作用不依赖FBXO22 的Fbox 结构域。随后，为验证AIF 是否通过FBXO22 与SCF复合体连接，在HEK293T 细胞中转染PBABE-Flag-CUL1/PBABE-Flag-EV、 PCDNA3.0-AIF 及 PLVXZSGreen-FBXO22进行IP，结果（图2D）显示Flag-CUL1成功沉淀SKP1、FBXO22 的同时也将AIF 沉淀下来，证明AIF通过FBXO22与SCF复合体相结合。

本研究通过变性条件泛素化IP 实验分析AIF 的泛素化水平，结果（图2E）显示过表达FBXO22 可显著增强AIF 的泛素化修饰水平，而过表达FBXO22-ΔF 对AIF 的泛素化修饰水平没有明显影响。

图2 IP检测FBXO22与AIF的相互作用及其对AIF泛素化水平的影响Fig 2 IP detection of the interaction between FBXO22 and AIF and its effect on the ubiquitination level of AIF

2.3 FBXO22对AIF蛋白表达水平的影响

采用蛋白质印迹（Western blotting）检测HEK293T细胞中敲低FBXO22 对AIF 蛋白水平的影响，结果（图3A）显示与shNC 组相比，shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 组的AIF 水平有明显增加。反之，本研究在HEK293T 细胞中转染过表达FBXO22 及FBXO22-ΔF 质粒，结果（图3B）显示，与PLVX-ZSGreen-EV 组相比，过表达FBXO22 可显著下调AIF 水平，而过表达FBXO22-ΔF却没有此作用。

此外，通过Western blotting 检测Fbxo22+/+和Fbxo22−/−型MEF细胞中AIF水平，结果（图3C）显示Fbxo22缺失可显著上调AIF的表达水平。通过Western blotting检测敲低FBXO22或XIAP对A549细胞中AIF水平的影响，结果（图3D）显示敲低FBXO22可显著上调AIF 水平，但敲低XIAP对AIF水平无较大影响。随后的结果（图3E～G）显示在SW620 细胞、HCT116 细胞以及PC3 细胞中敲低FBXO22 均可显著上调AIF 水平。以上结果均表明，FBXO22可负调控AIF的表达水平。

图3 Western blotting检测FBXO22对AIF水平的影响Fig 3 Effect of FBXO22 on AIF level by Western blotting

2.4 FBXO22对AIF介导的肿瘤细胞凋亡水平的影响

采用流式细胞术对经药物处理后的细胞进行分析，结果显示：①SW480 细胞（FBXO22 敲低细胞株） 经MNNG、H2O2处理后，结果显示，与shNC 组相比，shFBXO22#1 实验组和shFBXO22#2 实验组中凋亡细胞的占比均较高（图4A）。②经MNNG 诱导的SW620 细胞（FBXO22 过表达细胞株）中，PLVX-ZSGreen-FBXO22 实验组的凋亡细胞比例较PLVX-ZSGreen-EV 组有明显减少（图4B）；且在经H2O2诱导的SW480 细胞（FBXO22 过表达细胞株）中，PLVX-ZSGreen-FBXO22 实验组的凋亡细胞比例较PLVX-ZSGreen-EV 组亦有明显减少（图4C）。上述结果均表明，FBXO22可抑制由AIF介导的结肠肿瘤细胞凋亡。

图4 FBXO22对AIF介导的肿瘤细胞凋亡的影响Fig 4 Effect of FBXO22 on cancer cell apoptosis mediated by AIF

3 讨论

本课题组前期研究发现，FBXO22 可分别通过LKB1［12］和PTEN［13］促进肺癌细胞、结直肠癌细胞的增殖；且越来越多的研究［7-11］表明FBXO22 在多种肿瘤中表现为促进肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞转移的双重作用，具有重要的临床研究意义。本研究利用免疫沉淀技术挖掘FBXO22 的相互作用蛋白，经质谱鉴定显示在其相互作用表达谱中存在AIF；随后通过体外转染和免疫共沉淀实验证实，FBXO22与AIF存在相互作用。目前，关于AIF 表达调控的研究十分有限。本课题组前期研究发现，凋亡相关因子酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B［21］和CCAAT 增强子结合蛋白［22］仅调控AIF 的转录水平。有报道显示，P53 可在不依赖DNA 损伤应激的情况下促进AIF 转录［23］。在蛋白水平上，仅发现XIAP 能泛素化AIF但不能降解AIF，即仅影响AIF的酶活性［19-20］。本研究发现FBXO22可调控AIF的泛素化水平，即敲低FBXO22可使AIF 水平上调、过表达FBXO22可使AIF水平下调；因此，FBXO22 是目前首个可以在蛋白水平上调控AIF 的E3连接酶。

AIF在烷化剂损伤、氧化应激等刺激下可引起染色体凝集和DNA 大片段化，介导细胞凋亡［17-18］。研究［14-16］显示，MNNG 是一种被公认的可通过AIF 诱发细胞凋亡的烷化剂。本研究发现，敲低FBXO22 可上调AIF 的水平，进而增加在MNNG 诱导下结肠癌细胞的凋亡比例；反之，过表达FBXO22 则可下调AIF 水平，减少在MNNG 诱导下的凋亡比例；继而提示，FBXO22 可抑制由AIF 介导的结肠癌细胞凋亡，具有促肿瘤效应，与现有报道一致。

除了能够诱导细胞凋亡外，AIF 还能与CHCHD4（coiled-coil-helix-coiled-coil-helix-domain-containing protein 4）结合共同调节线粒体的氧化呼吸链，维持其正常功能，为细胞存活提供能量保障［24-26］。另有研究［27］发现，AIF 可以维持PTEN 的脂质磷酸酶的活性，抑制蛋白激酶B 活化，进而抑制β-catenin 信号通路，阻止上皮细胞-间充质转化和远处转移。然而，FBXO22 是否能通过调控AIF的蛋白水平对AIF介导的线粒体氧化呼吸功能和癌细胞转移功能产生影响，有待进一步探讨。

参·考·文·献

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