胚胎发育形态学和动力学特征在胚胎选择中的应用价值

郑爱燕，王玮，蒲艳，廖桂芝，孟庆霞，偶健，王馥新，李红，丁洁

(南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院生殖与遗传中心，苏州 215002)

胚胎非整倍性是导致体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠失败和早期流产的重要原因之一。胚胎植入前遗传学检测(PGT)的出现使胚胎非整倍性检出成为可能，但该操作需对滋养层细胞(TE)进行活检，具有创伤性，可能影响胚胎种植潜能[1]。另外，PGT价格昂贵，会增加患者的经济负担，其能否在IVF-ET领域广泛应用仍待商榷。因此，我们希望能够通过无创方法选择更具发育潜能的胚胎。从形态学角度评判胚胎质量是最直接也是目前最常用的方法。胚胎实时观测技术(Time-lapse)的出现使人们可以进一步观察胚胎发育的整个过程，以及胚胎的特殊分裂行为，如直接分裂(AC)、逆分裂(RC)和乱分裂(CC)等。有研究表明形态学指标、动力学指标与胚胎整倍性相关[2-4]，但也有学者持反对观点[5-6]。由于胚胎发育受培养环境等众多因素影响[7]，所以研究数据在不同实验室之间的可重复性差[8]。因此，本研究从形态学和动力学两个角度出发，分析本中心行PGT患者的临床资料，以寻找指导胚胎选择的形态学和动力学指标，优化胚胎选择方案以改善种植结局。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年1月至2018年12月于我院生殖与遗传中心就诊的行PGT患者的临床资料。

纳入标准：夫妻一方或双方染色体异常或有遗传疾病，反复妊娠丢失，反复种植失败，反复流产或高龄(年龄≥38岁)，且受精方式为卵胞浆内单精子注射(ICSI)者。排除标准：无可用囊胚的PGT周期或未放入时差培养箱培养的PGT周期。

本研究共纳入193个周期。根据胚胎整倍性分为整倍体囊胚组(整倍体组，共351个囊胚)和非整倍体囊胚组(非整倍体组，共491个囊胚)；整倍体组又根据是否种植分为种植胚胎组(种植组，共110例患者)和非种植胚胎组(非种植组，共51例患者)。

二、研究方法

1.促排卵及取卵：患者进行常规促排卵，待优势卵泡直径达18～20 mm时，长方案患者注射6 500 U重组人绒毛膜促性腺激素(默克，德国)，拮抗剂方案患者注射0.2 mg醋酸曲普瑞林(辉凌，瑞士)或2 000～40 000 U注射用人绒毛膜促性腺激素(珠海丽珠医药)+0.1 mg醋酸曲普瑞林，注射34～36 h后在阴道B超引导下取卵，将获得的卵丘卵母细胞复合体(COCs)洗涤干净后置于含蛋白的受精液G-IVF Plus(Vitrolife，瑞典)中备用。

2.胚胎实时观测和胚胎培养：获卵2～4 h后用透明质酸酶(Sage，美国)去除COCs周围的颗粒细胞，置于G1 plus培养液(Vitrolife，瑞典)中培养1～2 h行ICSI，ICSI后将卵母细胞放回G1 plus培养液于常规培养箱过夜，培养箱环境为6.0%CO2、5.0%O2、37℃。受精17～19 h后观察受精情况。将2PN合子放入培养皿(Embryoslide，Vitrolife，丹麦)，置于时差培养箱(Embryo Scope，Vitrolife，丹麦)进行培养，培养箱环境为6.0%CO2、5.0%O2、37℃，设置拍摄间隔为10 min，连续拍摄6 d。

3.Time-lapse系统和胚胎评分：运用Viewer D图像分析软件收集2PN胚胎资料，记录每个胚胎发育的关键时间点，包括原核消失、2细胞、3细胞、4细胞、5细胞、8细胞、桑椹胚融合、开始出现囊腔以及囊腔充满整个透明带的时间(tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB)，其中2细胞到3细胞的发育时间以cc2表示，3细胞到5细胞的发育时间以cc3表示，3细胞到4细胞的发育时间以s2表示，5细胞到8细胞的发育时间以s3表示，同时观察胚胎异常分裂行为AC和RC，其中AC1为胚胎第1次卵裂时1个细胞分裂为3个细胞的现象，AC2为胚胎除第1次卵裂以外其余各卵裂期1个细胞分裂为3个细胞的现象。胚胎动力学指标包括：tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB、cc2、cc3、s2、s3、桑椹胚融合到开始出现囊腔的时间(tSB-tM)和开始出现囊腔到囊腔充满整个透明带的时间(tB-tSB)。囊胚形态学评分采用Gardner评分体系[9]，形态学指标包括：囊胚发育天数(D5、D6)、内细胞团(ICM)评分和TE细胞评分。由于活检时对胚胎进行透明带打孔，所以未对活检囊胚进行囊胚扩张程度进行评判。

4.囊胚活检：胚胎培养至第4天在ICM对侧用透明带激光打孔器(ZIOS-tk，Hamilton Thorne Bio Sciences，美国)打孔，待≥5个TE细胞孵出后进行活检。固定孵出点对侧位，吸住孵出的TE细胞，利用牵引力和激光切割取下5～10个TE细胞，将TE细胞置于Gmops plus培养液(Vitrolife，瑞典)中漂洗3次后放于PCR小管备用。

5.二代测序PGT：活检后的TE细胞用SurePlex WGA Kit试剂盒(Blue Gnome，美国)进行全基因组扩增后构建文库。等温扩增和富集后用Ion Pgmtm Template OT2 200 Kit试剂盒(Thermo，美国)对文库DNA进行扩增，数据结果用E&S-胚胎染色体异倍性分析系统[10]分析。

6.囊胚解冻移植：患者自然周期或人工周期处理后进行复苏周期囊胚移植。优先移植整倍体囊胚，若有两个或两个以上整倍体囊胚，结合Gardner评分[9]和KID ScoreTM[11]D3/D5评分选择，每次移植1枚囊胚。

7.临床结局：移植后14 d测血β-HCG，β-HCG>10 U/L为阳性，阳性者于36 d后行B超检查，宫内见孕囊者为临床妊娠。

8.观察指标：各组胚胎动力学指标、形态学指标和胚胎特殊分裂(AC、RC)形式。整倍体率=整倍体胚胎数/二代测序检测胚胎数×100%，种植率=孕囊数/移植胚胎数(单卵双胎算1个孕囊)×100%。

三、统计学分析

结 果

一、纳入患者基本情况

纳入患者平均年龄(32.2±5.3)岁，体重指数(BMI)(21.8±3.0)kg/m2，FSH(7.2±2.1)U/L、E2(184.1±95.5)pmol/L、LH(5.3±3.9)U/L、抗苗勒管激素(AMH)(4.6±4.1)ng/ml、平均获卵数(13.9±7.4)枚、成熟卵数(11.7±6.5)枚、正常受精数(9.1±5.1)枚、形成可用囊胚数(5.0±3.5)枚。

二、整倍体组与非整倍体组胚胎发育动力学指标比较

与非整倍体组比较，整倍体组的tPNf、t2、t3、t4、t5、tM、tSB、tB以及tSB-tM等发育动力学指标均显著降低(P<0.05)，而t8、cc2、cc3、s2、s3和tB-tSB等发育动力学指标比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

三、种植组和非种植组患者的一般情况

根据是否种植将整倍体组又分为种植组和非种植组，两组患者的一般情况比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

四、种植组和非种植组胚胎发育动力学指标比较

非种植组的tSB-tM显著低于种植组(P<0.05)，其余各胚胎发育动力学指标比较均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

五、形态学指标和胚胎特殊分裂对囊胚整倍性及整倍体胚胎种植率的影响

D5囊胚的整倍体率显著高于D6囊胚(P<0.05)，ICM评分中A级囊胚的整倍体率显著高于B级、C级(P<0.05)，TE细胞评分A、B、C级的整倍体率逐级递减，差异具有统计学意义(P<0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)对囊胚的整倍体率无显著影响(P>0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)、囊胚发育天数、ICM评分和TE评分对整倍体囊胚的种植率均无显著影响(P>0.05)(表4)。

表1 整倍体组与非整倍体组胚胎发育动力学指标比较[(-±s)，h]

表2 种植组和非种植组患者一般情况比较(-±s)

表3 种植组和非种植组胚胎发育动力学指标比较 [(-±s)，h]

表4 形态学指标和胚胎特殊分裂对囊胚整倍性及整倍体胚胎种植率的影响(%)

讨 论

本研究以胚胎整倍性为基础，从胚胎发育的形态学和动力学角度出发，探索可能提高胚胎选择效率的参数。研究结果提示，D5囊胚的整倍体率(46.2%)显著高于D6囊胚(30.7%)，并且囊胚整倍性随ICM评分和TE评分升高而增高。整倍体胚胎除t8外，从tPNf到tB的所有细胞分裂时间点均显著早于非整倍体胚胎，提示胚胎生长发育速度快的囊胚更偏向于整倍体，跟D5活检囊胚整倍体率较高相呼应。本结论与Barash等[12]的结果一致，而Capalbo等[13]与Rienzi等[6]均认为D5囊胚和D6囊胚的整倍体率无显著差异。Capalbo等[13]关于ICM评分和TE评分对整倍体率影响的结论和本研究相似，认为随着ICM评分和TE评分的降低整倍体率显著降低(P<0.05)。Campbell等[14-15]发现，tM、tB、透明带厚度变为其原有厚度一半的时间(tEB)均与整倍体性显著相关(P<0.05)，并以此建立胚胎选择模型选择非植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)患者胚胎。尽管我们前期关于早期胚胎动力学与胚胎发育潜能的研究表明，cc2、cc3、s2和s3等动力学指标以及胚胎特殊分裂(AC和RC)对于囊胚形成均有显著影响(P<0.05)，但是这些指标对于囊胚的整倍性却无显著影响(P>0.05)，值得注意的是本研究的这几个指标的值均落在之前研究的优质胚胎参数范围内[16]。由此可知，这些指标虽然能够影响早期胚胎的发育潜能，在卵裂期胚胎选择中起积极的指导意义，但是当卵裂期胚胎形成囊胚后，这些指标并不能预测囊胚整倍性。Desai等[2]也认为胚胎特殊分裂(AC、RC和CC)和胚胎整倍性不相关，但胚胎特殊分裂(AC和CC)与胚胎发育潜能相关，两种或以上不同分裂异常行为会导致囊胚整倍体率显著降低(P<0.05)。我们推测其原因可能是由于囊胚生长发育过程本身就是一个胚胎筛选过程，胚胎发育过程中的自我纠错能力，包括异常细胞的碎片化、桑椹胚形成时细胞的不融合和排出等，使得这些原本具有错误分裂的胚胎得到纠正。Lagalla等[17]研究也证实胚胎特殊分裂AC可产生整倍体胚胎。

关于整倍体囊胚种植方面，本研究发现囊胚的形态学评分，即囊胚发育天数、ICM评分和TE评分并不对整倍体囊胚的种植力有预示作用，即选择形态学更优质的整倍体囊胚并不能提高种植率。Capalbo等[13]也发现整倍体囊胚的种植率跟囊胚的形态和生长速度不相关，但Nazem等[18]和Zhao等[19]却认为相关。Kimelman等[20]研究发现，在未进行整倍体检测的囊胚中，D6囊胚的妊娠率和出生率均显著低于D5囊胚，但是在整倍体囊胚中D6整倍体囊胚的妊娠率和出生率与D5囊胚无显著差异。因此，我们推测囊胚形态学评分跟种植率的相关性可能只是囊胚形态学评分跟胚胎整倍体相关性的映射。Gazzo等[21]研究发现，EmbryoscopeTM时差培养箱的KS5评分体系可以提高整倍体胚胎的种植率，而本研究发现tSB-tM与整倍体囊胚的种植率相关，种植组tSB-tM显著大于未种植组(P<0.05)，也就是种植的整倍体囊胚从桑椹胚形成到出现囊胚腔的时间更长，即当评估整倍体性时tSB-tM在整倍体囊胚偏向更短，但是在评估整倍体囊胚的种植时，该值在种植组胚胎偏向于更长。即从桑椹胚形成到开始出现囊腔的时间不能太短也不能太长，需在一个特定范围内。桑椹胚到囊胚的发育过程存在一系列变化，如卵裂球致密化、卵裂球间形成紧密和缝隙连接、大量表面微绒毛和细胞膜其它成分的重排、胚胎转录和翻译过程增强等。细胞失去全能性，获得呈放射状的极性，最终产生两个细胞群，具有表面微绒毛的外极细胞变成TE，具有紧密联系的内极细胞变成ICM。由此推测这一进程发展的过快或过慢，都可能会导致某些重要环节出错，进而影响胚胎发育，甚至后续的临床结局。Kramer等[22]研究也发现桑椹期致密化的持续时间和人类胚胎整倍体染色体组成之间存在显著相关。另外，本研究由于样本数比较少，且种植不仅受胚胎因素影响，还受子宫内膜等多种因素影响，究竟tSB-tM是否能够作为预测整倍体囊胚种植潜能的动力学指标，我们需谨慎对待，还需进行临床验证。

综上，我们认为胚胎发育时间点发生早的，ICM评分和TE评分高的D5囊胚其整倍体率较高，但若已知胚胎是整倍体时，这些形态学和细胞分裂时间点不能预测种植结局，而寻找那些从桑椹胚形成到开始出现囊胚腔时间略长的整倍体囊胚也许能获得更好的种植结局。对于一般IVF-ET周期，胚胎上述指标可作为胚胎优选的候选指标，提高临床结局；对于PGT-A周期，可利用Time-lapse技术致力于获得整倍体胚胎更高的种植率。