橘红茶香气特征及风味成分分析

刘盼盼，郑鹏程，龚自明,*，常泽睿,3，苏方俊，黄 波，冯 琳，高士伟，郑 琳

（1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北省茶叶工程技术研究中心，湖北 武汉 430064；2.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；3.华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430070；4.湖北金果茶业股份有限公司，湖北 恩施 444333）

橘红茶是由柑橘皮与红茶经过采摘、洗果、切帽、取肉、干燥、入茶、烘焙等一系列特殊工艺加工而成，成品呈圆形、橘黄鲜亮、香气馥郁，融合了柑橘壳的果香味和红茶甜香味，故其滋味独特，茶性温和甘醇，老少皆宜，具有疏肝润肺、止咳降糖[1-2]、抑菌、抗氧化和抗肿瘤[3-4]、减肥降脂[5-6]等功效，深受消费者喜爱。

香气是茶叶重要品质因子，同时也是消费者追求茶叶消费的重要导向之一。目前，关于柑普茶特征及化学成分的研究已经取得了重要进展，多种特征性风味物质及功能成分被认知，如柑普茶挥发性成分以烯烃类成分为主，非挥发性成分主要有橙皮苷、儿茶素等[7-8]，这对客观评价柑普茶的品质、指导其加工过程调控有着积极意义。而对于柑橘与红茶结合后形成的橘红茶风味变化的研究较少，有待深入。不同柑橘原料制作的橘红茶风味特征不同，只有明确橘红茶产品的风味特征，才能更好地完善产品质量，从而获得消费者的认可和喜爱。据此，本研究拟选取宜红茶、南丰蜜橘、砂糖橘为研究对象，采用定量描述分析，顶空固相微萃取技术并结合气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）和气相色谱-质谱-嗅闻（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GCMS-O）等现代技术分析不同橘红茶的香气特征及挥发性风味成分，结合相关性分析、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计分析手段，明确其特征香气成分，比较分析橘红茶与其原料间的成分差异，旨在为橘红茶的品质判定及加工过程品质调控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品信息见表1，宜红茶、南丰蜜橘壳、砂糖橘壳、橘红茶A和橘红茶B等一系列样品均按照表1中的工艺方法加工而成，每个样品重复3 次，原料由湖北金果茶业股份有限公司提供，供试样于4 ℃冷藏保存。

癸酸乙酯、正构烷烃（C6～C30）等（均为色谱纯，纯度＞98.0%） Sigma-Aldrich（上海）公司。

表1 样品信息Table 1 Information about tea samples tested in this study

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪、5975C质谱仪 美国Agilent公司；ODP3闻香仪 德国Gerstel公司；手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头美国Supeclo公司；HHS型恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 感官评价方法

样品按照1∶50茶水比冲泡，评价小组由5 位经过感官培训的专业人员组成，对橘红茶及其原料的香气属性以及香气强度进行评分（表2），采用10分制[9]（0～2 分微强，2～4 分较强，4～6 分强，6～8 分很强，8～10 分极强）。具体感官术语及标准品参照见表2。

表2 橘红茶感官术语及其定义Table 2 Sensory terms of Juhong tea and their definitions

1.3.2 顶空固相微萃取法[10]

根据GB/T 8303—2013《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》中的试样制备法，取出茶样混匀，磨碎，作为待测试样。橘壳的磨碎方法参照茶样，先混匀后，用磨碎机磨碎，作为待测试样。称取1 g样品放入萃取瓶中，加入30 mL沸水，然后将装有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（实验前在250 ℃老化15 min）的固相微萃取手持器通过瓶盖的橡皮垫插入到萃取瓶中，在60 ℃水浴中平衡10 min，推出纤维头，吸附50 min后，取出并立即插入气相色谱仪的进样口中，解吸附3 min，同时启动仪器收集数据。

1.3.3 橘红茶及其原料挥发性成分的GC-MS分析

GC条件：安捷伦HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱。进样口温度240 ℃，电子捕获检测器温度250 ℃；载气为高纯氦气；流速1.8 mL/min。柱温程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min；实验中尽量将峰分开，保证峰形的对称完整，然后通过质谱进行定性分析。

MS条件：电子电离能量为70 eV；质量扫描范围为50～600 u；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；质谱传输线温度为280 ℃。

物质鉴定：利用NIST11.L谱库对得到的质谱图进行检索和人工解析。査对有关质谱资料，对基峰、质荷比和相对峰度等方面进行分析，结合保留时间和质谱分别对各峰加以确认。采用内标癸酸乙酯定量香气成分，计算如式（1）所示：

1.3.4 橘红茶及其原料挥发性成分的GC-MS-O分析

气相色谱-质谱条件同1.3.3节。

嗅闻条件：嗅闻系统传输线温度220 ℃，嗅闻口温度200 ℃，加湿器流速12 mL/min。流出成分在毛细管末端以1∶1的分流比流入闻香器。载气为氮气，流速为1 mL/min。

挑选3 名经过专业闻香培训的品评人员进行闻香分析。应用时间强度法，记录香气出现时间、香气特征和香气强度（aroma intensity，AI），AI以0～5六个级别表述，“0”表示未闻到，“3”表示AI中等，“5”表示AI非常强。每人对每个组分闻香2 次，每个化合物的AI为6 次闻香结果的平均值。

1.3.5 橘红茶挥发性成分的OAV计算

OAV为某化合物质量浓度与该物质嗅觉阈值的比值，按式（2）计算：

式中：Ci为某个化合物的质量浓度/（μg/L）；Ti为该物质的气味阈值/（μg/L）。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件、Simca-P 13.0进行方差分析、相关性分析及OPLS-DA。

2 结果与分析

2.1 红茶及其原料香气风味轮廓分析

由图1可以看出，宜红茶、南丰蜜橘壳、砂糖橘壳和两个橘红茶样品在各个感官属性上的强度值及其风味存在差异。宜红茶的甜香显著高于南丰蜜橘壳和砂糖橘壳，而果香与青香则显著低于2 个柑橘壳。橘红茶的果香最突出，强度接近其柑橘壳，其次为甜香，而青香强度最弱。宜红茶与柑橘壳经过加工后的橘红茶风味强度介于两者之间，融合了柑橘壳的果香味和红茶甜香味，香气更加馥郁。

图1 橘红茶香气感官雷达图Fig. 1 Aroma profiles of of Juhong tea

2.2 橘红茶及其原料主要挥发性风味成分分析

图2 宜红茶（a）、南丰蜜橘壳（b）、砂糖橘壳（c）、橘红茶A（d）与橘红茶B（e）挥发性成分GC-MS总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatile components in Yihong black tea (a), Nanfeng mandarin peel (b), Shatangju mandarin peel (c), Juhong tea A (d) and Juhong tea B (e)

GC-MS分析橘红茶及其原料样品挥发性成分的总离子色谱图见图2，宜红茶、柑橘壳及橘红茶的挥发性组分见表3。5 个样品中共检测到92 个挥发性化合物，香气总量为343.48～10 175.40 μg/L，其中质量浓度较高的成分有柠檬烯（30.45～4 248.52 μg/L）、芳樟醇（14.30～1 409.96 μg/L）、百里香酚（0～782.22 μg/L）和α-法尼烯（4.11～339.68 μg/L）。这些化合物主要是萜烯类物质，研究表明，萜烯类化合物是由前体物质异戊二烯基焦磷酸和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸在相关酶的作用下合成的[11]，且大都带有浓郁的甜香、花香和木香，是各类茶的主要挥发性成分[12]，也是构成橘红茶甜香与果香重要的物质基础。红茶与柑橘皮共有成分有8 个，包括柠檬烯、α-法尼烯、芳樟醇等，可见香气物质基础的差异形成了不同的风味特征。

表3 橘红茶及其原料挥发性风味成分的GC-MS-O分析Table 3 Analysis of volatile components of Juhong tea and its raw materials by GC-MS-O

续表3

图3 橘红茶及其原料挥发性物质种类及相对含量Fig. 3 Types and contents of volatile components in Juhong tea samples

橘红茶样品挥发性化合物包括醛类23 种，醇类23 种，烯类20 种，酮类9 种，酯类9 种和其他类8 种（图3）。其中烯类物质含量最高，平均含量为70.67%，烯类化合物中含量较多柠檬烯、γ-萜品烯、α-法尼烯、月桂烯和β-蒎烯等，与很多研究结果相似，柑橘属的橙子、柠檬、柚子等的挥发性成分也以萜烯类为主[13-14]，另外柠檬烯组分占砂糖橘壳香气总量的87.60%，远高于在南丰蜜橘壳中的比例（53.05%），这是砂糖橘壳果香风味高于南丰蜜橘壳的重要因素；其次为醇类化合物，平均含量为16.39%，醇类化合物中含量较多有芳樟醇、α-萜品醇、香叶醇和萜烯醇等，与其他研究相近，醇类是红茶香气中的主要物质[15-16]；再次为醛类物质，平均含量为4.72%，醛类化合物中含量较多有辛醛、癸醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等；接着为酯类物质，平均含量为3.58%，酯类化合物中含量较多有水杨酸甲酯、乙酸香叶醇酯和乙酸橙花醇酯等；而酮类及其他类物质含量较低。

由表3可知，橘红茶及其原料样品经过GC-MS-O分析，共检测到20 种香气活性物质，其中4 种香气成分（AI≥2.0）对橘红茶的风味有较大贡献，分别为柠檬烯（柑橘香）、β-紫罗酮（花香）、月桂烯（柠檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。柠檬烯具有柠檬、柑橘的味道，赋予橘红茶清新的果香和诱人的柑橘香[17]；β-紫罗酮具有紫罗兰香气，花香浓郁，对橘红茶香气影响较大[18]；月桂烯具有柠檬、木香等风味；芳樟醇具有温和、甜的花香。这些香气活性成分为橘红茶果香和花香悠长的重要物质基础。

2.3 橘红茶及其原料主要挥发性物质的OAV分析

OAV能确切地评价单一香气组分对整体香气的贡献度。一般认为OAV≥1的化合物为呈香的关键化合物[23]。本研究参照相关文献中部分化合物在水中的阈值计算出各化合物的OAV，从表4可以看出，以OAV≥1为标准从橘红茶及其原料中筛选出了11 种关键香气物质，其中β-紫罗酮、柠檬烯、β-大马烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘红茶及其原料中的OAV均值达到10以上，对花香、果香及甜香等风味特征的构成有重要贡献。

表4 橘红茶主要挥发性成分的阈值及OAV分析Table 4 Odor thresholds and OAV of important volatile compounds in Juhong tea samples

由表4可知，香气活性成分以醛类物质最为主要，占其中55%。现有研究表明，脂肪族醛类（(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、癸醛、月桂醛、(E)-2-癸烯醛和(E)-2-壬烯醛）的沸点低、阈值较小，具有脂肪味、果香、皂香等风味，对橘红茶果香的贡献较大。β-紫罗兰酮阈值极低，可能是橘红茶中花香馥郁的特征物质。β-大马烯酮仅存在于红茶原料中，在柑橘皮中未检出，其阈值与β-紫罗兰酮相近[24]，呈现甜香，可能是橘红茶中甜香的特征物质。这些酮类化合物可能来源于类胡萝卜素的氧化和缩合反应及β-胡萝卜素的氧化分解反应[25]。柠檬烯在柑橘皮中含量非常高，阈值相对较低，是橘红茶果香风味的重要组成物质。芳樟醇在南丰蜜橘皮中含量远高于砂糖橘和宜红茶，可能是橘红茶A与橘红茶B花香强度的主要差异物质。

2.4 影响橘红茶及其原料香气品质的关键挥发性成分分析

基于橘红茶香气分属性的感官评分（图1）与挥发性成分含量水平（表3），采用SPSS软件进行了相关性分析，进一步得到了影响橘红茶香气品质的关键香气成分（表5）。其中月桂烯和香茅醛与果香呈极显著正相关（P＜0.01），苯乙醛和苯乙醇与甜香呈极显著正相关（P＜0.01），芳樟醇、百里香酚、乙酸香叶醇酯、β-榄香烯、β-紫罗酮和α-法尼烯与花香呈极显著正相关（P＜0.01），香茅醛与青香呈极显著正相关（P＜0.01），月桂烯、香茅醛和月桂醛与木香呈极显著正相关（P＜0.01）。月桂烯、香茅醛和月桂醛都与果香、木香相关性较高，研究发现这些成分均呈现出果香（柠檬）、松木香等风味。苯乙醛和苯乙醇属于芳香族物质，均具有明显甜香、花香特征[26]。百里香酚呈现百里香味[27]，乙酸香叶醇酯具有玫瑰花香[28]，β-榄香烯具药草香[29]，β-紫罗酮具有紫罗兰花香[20]，这些成分所呈现的特殊花香共同形成了橘红茶浓郁的花香风味。

表5 橘红茶及其原料香气得分与关键成分含量相关性分析Table 5 Analysis of correlation between aroma score and concentrations of key components

2.5 橘红茶与柑橘壳及宜红茶原料挥发性成分的差异分析

为比较橘红茶与柑橘壳及宜红茶原料挥发性成分的差异，对所有样品的挥发性成分进行多元统计分析，基于各样品间挥发性成分的检测结果建立了OPLS-DA模型，对于潜在的差异挥发性成分，使用变量投影重要性因子（variable importance in projection，VIP）值大于1的进行不同样品差异挥发性成分筛选。由图4可知，宜红茶与柑橘壳、橘红茶与宜红茶、橘红茶与柑橘壳的差异分析表明VIP高于1且标准误差低于0.5的化合物分别有18、20 种和9 种。宜红茶与柑橘壳的标志差异性挥发性成分为橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等，其中橙花醇、(E)-氧化芳樟醇等10 种成分为宜红茶特有，香茅醛、β-香茅醇等5 个成分为柑橘壳特有，而月桂烯、柠檬烯和(E)-β-罗勒烯为共有成分；橘红茶与宜红茶的标志差异性挥发性成分为(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水杨酸甲酯等，其中(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醛和(Z)-氧化芳樟醇仅存在于宜红茶中，可能是在加工过程中损失而在橘红茶中未检出，香芹酮、乙酸香茅酯等10 个成分为橘红茶特有，水杨酸甲酯、香叶醇等6 个为共性成分；橘红茶与柑橘壳的标志差异性挥发性成分为壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等，其中α-古巴烯、β-蒎烯和α-摩勒烯是柑橘壳中特有，可能是在加工过程中损失而在橘红茶中未检出，其他6 个均为共性成分。从差异成分可以看出，柑橘壳中特有的成分主要是萜烯类，包括萜烯醛和萜烯酯类，研究表明萜烯醛类是相应的醇在乙醇脱氢酶作用下产生，而萜烯酯类在乙酰辅酶A、乙醇乙酰转移酶的作用下产生[30-31]。

图4 橘红茶与宜红茶及柑橘壳的香气差异成分的VIP值Fig. 4 VIP values of volatile components differed between Juhong tea,Yihong black tea and citrus peel samples

3 结 论

橘红茶与宜红茶及柑橘壳样品共定性出92 种挥发性风味化合物，其中萜烯类物质的含量较高。烯类和醇类是橘红茶中主要的挥发性化合物，可能对橘红茶的香气品质形成起着关键的作用。通过GC-MS-O共嗅闻出气味活性化合物20 种，其中4 种挥发性成分（AI≥2.0）对橘红茶的风味有较大贡献，分别为柠檬烯（柑橘香）、β-紫罗酮（花香）、月桂烯（柠檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。从OAV结果看，橘红茶系列样品中有11 种化合物OAV不低于1，其中β-紫罗酮、柠檬烯、β-大马烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘红茶及其原料中的OAV均值达到10以上，对花香、果香及甜香等风味特征的构成有重要贡献。综合OAV及AI值，柠檬烯、β-紫罗酮、芳樟醇、癸醛、β-大马烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛和辛醛可能是橘红茶中重要的挥发性化合物。相关性分析结果表明，月桂烯、苯乙醛、芳樟醇等11 个挥发性成分对果香、花香、甜香、青香和木香风味属性的表征有较大贡献。OPLS分析表明，宜红茶与柑橘壳的标志差异性挥发性成分为橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等18 种，橘红茶与宜红茶的标志差异性挥发性成分为(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水杨酸甲酯等20 种，橘红茶与柑橘壳的标志差异性挥发性成分为壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等9 种。本研究对湖北省橘红茶及其原料的香气特征及关键呈香成分进行分析，后续研究中针对鉴定出的关键呈香成分，需进行系统的香气重组、缺失实验进一步验证关键呈香成分的致香效果。同时橘红茶关键呈香成分在加工过程中的变化也尚不明晰，有必要进一步明确橘红茶特征香气的形成机制，为提高橘红茶产品质量提供依据。