预处理方式对鳙鱼骨蛋白酶解液游离氨基酸和挥发性成分的影响

董 烨，张益奇,2,3,*，姚洪正，何光喜，戴志远,2,3,*

（1.浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310035；3.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116000；4.杭州千岛湖发展集团有限公司，浙江 杭州 311701）

鳙鱼（Aristichthys nobilis）为我国著名的“四大家鱼”之一，其繁殖速度快，产量大。鳙鱼头因其味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱[1]。由于对鳙鱼头的需求不断增长，在加工过程中产生了大量的鱼鳞、鱼骨及鱼皮等副产物。其中，鱼骨富含蛋白质、不饱和脂肪酸、钙、磷等营养成分[2]，但由于我国目前对鱼骨的开发研究较为落后，其通常被直接丢弃，造成资源浪费及环境污染。因此，丰富鱼骨蛋白资源的高值化利用，具有一定的研究意义。

蛋白质酶解技术反应条件温和，较为安全，近年来被广泛应用于水产蛋白资源的开发利用[3]。但是鱼骨结构坚固，因此直接酶解效率低，所需时间长。研究发现，适度热处理可以使蛋白质的刚性结构柔性化，从而利于蛋白的提取或酶解，提高酶解效率[4]。Fan Weiwei等[5]采用热处理技术将虹鳟鱼骨于121 ℃处理30 min提取鱼骨蛋白进行酶解，发现碱性蛋白酶酶解效率最高，其水解度可达15.03%，水解过程中气味发生了变化，酶解液中共检测到18 种游离氨基酸和71 种挥发性成分。Tan Xiaoyi等[6]将鳕鱼骨于121 ℃处理90 min，对所得鱼骨蛋白进行酶解，发现酶解液具有较好的营养价值。近年来，汽爆处理作为一种绿色高效的物理化学预处理方法，广泛应用于生物质原料的预处理。其基于短时高温高压蒸煮，高压蒸汽进入原料内部空隙，然后瞬间泄压，将蒸汽内能转化为机械能并作用于物料，使物料充分解离[7]。目前，汽爆技术在预处理动物材料方面，尤其是处理坚硬骨质方面的研究，得到越来越广泛的关注。采用汽爆技术处理动物骨，使其在高温条件下发生软化，在饱和水蒸汽作用下，骨质被润胀，孔隙中充满蒸汽，当瞬间泄压时，介质急剧膨胀，水蒸气进行绝热膨胀做功，蒸汽内能转化为机械能作用于骨质层间，骨质解离内部胶原蛋白发生裂解，骨质内营养物质流出，同时酶切位点暴露，提高酶解效率。张天鹏等[8]采用汽爆技术处理鸡骨，当压力2.4 MPa、保压时间680 s时，可以较好地提取鸡骨架中的营养物质。Shen Qingshan等[9]发现采用汽爆技术液化鸡胸骨软骨，可以用于硫酸软骨素的分离，并取得了较好的效果。涂丹等[10]采用汽爆辅助酶解鱼皮制备血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，经0.6 MPa/0.5 min汽爆处理的鱼皮，水解度比未处理组提高了1.8 倍，ACE抑制率比未处理组提高了27.14%。但目前，汽爆预处理鱼骨对酶解液游离氨基酸和挥发性成分的影响仍鲜见报道。

本实验采用胰蛋白酶对经汽爆水提处理和热处理的2 种鱼骨蛋白进行酶解，对所得2 种酶解液中游离氨基酸、挥发性物质及分子质量分布进行分析，旨在为提高鱼骨资源利用率及其应用领域提供基础数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳙鱼鱼骨 杭州千岛湖发展集团有限公司；氢氧化钠、胰蛋白酶、甲醛（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；碳酸酐酶（29 kDa）、细胞色素C（12.4 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL）（429 Da）美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

QBS 200B汽爆机 正道生物能源公司；MLS-3781L高压灭菌锅 日本Panasonic公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂层萃取头 美国Supelco公司；7890A气相色谱仪 美国Agilent公司；Trace GC Ultra气相色谱-DSQ II质谱联用仪、Fresco 21冷冻高速离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；S-433D全自动氨基酸分析仪 德国Sykam公司；e2695高效液相色谱 美国Waters公司；400Y多功能粉碎机永康市铂欧五金制品有限公司；DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；K-360凯氏定氮仪、K-425快速消解仪 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 汽爆处理

新鲜鱼骨用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，每2 h换一次溶液，除去杂蛋白，流水冲至中性，沥干备用。取200 g斩碎至6 cm左右的鱼骨置于预热好的汽爆机内，于0.6 MPa保压2 min，然后在0.1 s内瞬间泄压，将样品喷至接收器中，收集汽爆后的样品粉碎至40 目左右后，于60 ℃水中搅拌使骨蛋白溶于水中，过滤去除骨残渣，收集滤液为得到的鱼骨蛋白提取溶液，冷冻干燥。

1.3.2 热处理

将鱼骨斩碎至0.5 cm左右的骨块，按料液比1∶3（g/mL）加入蒸馏水，121 ℃提取70 min，过滤去除骨残渣，收集滤液冷冻干燥。

1.3.3 酶解液的制备

取鱼骨蛋白的冻干粉配制成3 g/100 mL的鱼骨蛋白溶液，维持溶液pH值为8，酶解温度为37 ℃，酶比底1∶50（m/m），加入胰蛋白酶，酶解3 h后，于沸水浴中灭酶10 min，8 000 r/min离心15 min，得到2 种酶解物上清液（汽爆预处理鱼骨蛋白酶解液记为SFBPH，热预处理组鱼骨蛋白酶解液记为HFBPH）。

1.3.4 水解度测定

采用甲醛滴定法[11]，按下式计算：

1.3.5 游离氨基酸测定及滋味贡献评价

游离氨基酸采用氨基酸自动分析仪进行测定，分别统计总游离氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量。滋味贡献评价采用呈味强度值（taste activity value，TAV），即某一呈味物质的浓度与其阈值的比值[12]。

1.3.6 挥发性成分分析

固相微萃取条件：将2 mL酶解液置于顶空瓶中，然后将密封小瓶在50 ℃下保温10 min。并将活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入进样瓶顶空部分，60 ℃吸附30 min，取出后插入气相色谱进样口，250 ℃解吸3 min。

气相色谱条件：TR-35 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气；进样口温度250 ℃，不分流进样；升温程序：初始温度35 ℃，保持3 min，以2.5 ℃/min升至70 ℃，再以8 ℃/min升至150 ℃，最后以20 ℃/min的速率上升到230 ℃，保持5 min。

质谱条件：检测器温度280 ℃；离子源温度200 ℃；电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；质量扫描范围m/z30～500。

1.3.7 分子质量分布

参照Zhang Yiqi等[13]的方法。采用Waters e2695高效液相色谱系统和紫外-可见检测器，检测波长220 nm，色谱柱为G2000 SWxl（7.8 mm×300 mm），流动相A为乙腈，流动相B为0.1%三氟乙酸溶液，45% A、55% B等度洗脱，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，时间30 min。分子质量校正曲线所用标准品为：HHL（429 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、细胞色素C（12 400 Da）、碳酸酐酶（29 000 Da）。

1.4 数据处理

酶解液中挥发性成分通过NIST 2.0谱库进行定性分析，且仅当正反匹配度均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果予以保留。采用OriginPro 2018绘图，SPSS 21.0进行数据处理及显著性检验，P＜0.05，差异显著，实验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 水解度分析

图1 预处理对鱼骨蛋白酶解液水解度的影响Fig. 1 Effects of different pretreatments on the hydrolysis degree of fish bone protein hydrolysates

鱼骨汽爆水提处理后所得冻干粉蛋白质得率为11.83%，而热处理后蛋白质得率为8.57%，这可能是汽爆处理使胶原蛋白链展开，在60 ℃水提作用下，促进鱼骨蛋白的溶出。采用胰蛋白酶对这2 种冻干粉酶解3 h，如图1所示，HFBPH的水解度为20.59%，SFBPH的水解度为24.85%，高于HFBPH，这可能是在汽爆作用下，鱼骨胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度大，蛋白质结构疏展，部分蛋白直接降解为小分子物质，暴露出更多酶切位点，更易于酶切，水解度增大，酶解效率高。后续可对经汽爆处理后的鱼骨表面黏液测定其分子质量，验证鱼骨胶原蛋白经汽爆处理后发生了降解。

2.2 酶解液游离氨基酸分析

由表1可知，2 种酶解液中均检测出20 种游离氨基酸，SFBPH总游离氨基酸质量浓度为28.36 mg/mL，是HFBPH（21.78 mg/mL）的1.3 倍，其中亮氨酸在2 种酶解液中的含量最高，分别占总游离氨基酸的25.07%和18.45%。其次为赖氨酸，分别占总游离氨基酸的15.83%和13.91%，均为苦味氨基酸。游离氨基酸对酶解液的整体风味影响较大，是重要的滋味物质，也是香味的前体物质。每种氨基酸的结构特性不同，产生了其独特的口味特征，根据氨基酸的呈味特性，分为鲜味、甜味、苦味3 种[14]。SFBPH和HFBPH中呈味氨基酸含量丰富，分别占总游离氨基酸的78.70%和78.60%，其中疏水性氨基酸分别占54.78%和56.06%，游离氨基酸的呈味特性与氨基酸的疏水性大小有关，当疏水性大时主要呈苦味，疏水性小时主要呈甜味。

表1 2 种鱼骨蛋白酶解液中游离氨基酸分类及含量Table 1 Composition and contents of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

表2 2 种鱼骨蛋白酶解液中呈味游离氨基酸TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

TAV大于1时，表示该物质对样品的呈味有贡献，值越大其贡献越大，当TAV小于1时，该物质对样品的呈味无贡献[15]。表2对SFBPH和HFBPH的呈味氨基酸TAV进行比较。鲜味氨基酸中，2 种酶解液的谷氨酸TAV均大于1，且在SFBPH中稍高于HFBPH，表明SFBPH鲜味较HFBPH突出。天冬氨酸的TAV均小于1，对酶解液鲜味贡献较小，谷氨酸对鱼骨酶解液鲜味的贡献大于天冬氨酸。SFBPH和HFBPH中甜味氨基酸分别占总游离氨基酸的10.22%和10.05%，2 种酶解液中甜味氨基酸的TAV均较低，说明甜味在鱼骨酶解液的滋味中体现较少。2 种酶解液中缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸这3 种苦味氨基酸的TAV均小于1，研究发现苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸，当其含量低于呈味阈值时，可增加其他氨基酸的鲜味和甜味[16]。SFBPH和HFBPH中苦味氨基酸TAV大于1的共有5 种，分别为亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和精氨酸。TAV最高的苦味氨基酸分别是赖氨酸和甲硫氨酸。HFBPH中甲硫氨酸TAV高达8.80，SFBPH中甲硫氨酸TAV为5.29。甲硫氨酸这类含硫氨基酸对熟肉香味的形成具有重要贡献[17]。在SFBPH中精氨酸TAV大于1，精氨酸虽显苦味，但有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[18]。SFBPH和HFBPH的苦味氨基酸含量较高，在总游离氨基酸中百分比分别为64.88%和64.23%，2 种酶解液的整体风味以苦味为主，如何脱苦改善酶解液风味，是亟待解决的问题。

2.3 固相微萃取-气相色谱-质谱分析

图2 2 种鱼骨蛋白酶解液中挥发性物质含量和组成Fig. 2 Contents of various classes of volatile substances in two fish bone protein hydrolysates

如图2所示，实验测得含量较多的物质是烃类和醛类，SFBPH和HFBPH中烃类和醛类物质之和，分别占总挥发性物质的44.69%和21.2%。在SFBPH中醛类、烃类、酮类和杂环类的相对含量高于HFBPH，而醇类、酸类和酯类的相对含量低于HFBPH，这可能较长的热处理过程中发生了美拉德反应或氨基酸的热分解反应。表3列出了2 种酶解液中的各自含有的挥发性化合物，共检测出77 种。其中SFBPH挥发性化合物数量最多达61 种，而HFBPH为47 种，其中共有成分有31 种。

表3 2 种鱼骨蛋白酶解液的挥发性成分组成Table 3 Compositions of volatile components in two fish bone protein hydrolysates

续表3

烃类物质主要是烷烃类和烯烃类。烃类物质阈值相对较高，对酶解液的整体风味作用不大[19]，其主要是源于脂肪酸烷氧自由基的裂解。而当存在支链烷烃、芳香烃和烯烃时，可能对酶解液的风味有一定的贡献[20]。由表3可知，SFBPH中烃类物质主要有十七烷、十八烷和(Z)-3-十七烯，HFBPH中主要有十七烷和十八烷。SFBPH中烃类物质相对含量高于HFBPH，可能与其水解度较高有关。芳香烃可能由芳香族的游离氨基酸氧化产生，酶解液中还检测到的对二甲苯和萘等芳香烃化合物会导致酶解液异味的产生，可能与鱼类生长环境受到污染有关[21-22]。

SFBPH和HFBPH中共检测出8 种杂环类化合物，主要有呋喃、吡啶和噻唑，其中SFBPH中检测出的杂环化合物相对含量稍高，而HFBPH中检测出的杂环化合物种类相对较多。杂环类化合物一般阈值较低，对酶解液整体风味贡献较大。呋喃类主要是氨基酸的热分解、脂肪氧化和美拉德反应产生，通常具有很强的肉香味，可以起到一定的增香作用，如2-戊基呋喃具有类似火腿的香味[23]。此外，2 种酶解液中还检测到少量酸类、酯类和酚类物质。酸类物质的阈值很高，对酶解液的风味影响不大。酚类相对含量低，对酶解液的整体风味影响不大，酯类通常具有果香和清香气味，与酮类共存时对酶解液的风味有协调和平衡的作用[24]。

醛类是酶解液主要的挥发性物质之一，2 种酶解液中共检测出17 种醛类物质。其中SFBPH中共检出16 种醛类化合物，相对含量为15.63%，相对含量较高的有壬醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、2,4-二甲基苯甲醛、十二醛。HFBPH中共检测出11 种，相对含量为4.11%，相对含量较高的有2,5-二甲基苯甲醛和壬醛。SFBPH中醛类的挥发性成分相对含量高于HFBPH。醛类物质主要源于氨基酸的Strecker降解反应或脂肪的氧化，其碳原子个数为6～9的醛具有果香、清香和脂肪香味[25]，阈值较低，具有与其他物质重叠的风味效应，对酶解液的整体风味特征具有贡献[26]。壬醛具有油脂和甜橙气息，己醛通常产生一种原生味、鲜香和类醛的特征香味，相对含量较高时，具有青草味-脂肪味，(E)-2-辛烯醛呈脂肪味[27]，(E,Z)-2,6-壬二烯醛是产生鱼腥味的主要化合物[28]，苯甲醛具有强烈的坚果香，在SFBPH中相对含量较高。

2 种酶解液中酮类物质和醇类物质相对含量和种类较少。在SFBPH中检测到4 种酮类，含量稍高的是2,3-辛二酮，其具有强烈的奶油味，是新鲜水产品的重要风味物质[29]。2-壬酮具有水果香和花香。酮类物质阈值一般高于醛类，但其具有特殊的花香、清香和水果香，对酶解液的风味形成具有一定作用。醇类主要来源于氨基酸和糖的还原、脂肪酸酶促氧化和醛类物质等[30]，其中HFBPH中醇类物质相对含量高于SFBPH。醇类物质一般具有独特的花香、果香、清香和甜味等令人愉悦的风味。2 种酶解液中共检测到9 种醇类物质，主要是饱和醇类。饱和醇类的阈值较高，对酶解液风味贡献不大。

2.4 酶解液分子质量分布

进一步测定2 种鱼骨蛋白酶解液分子质量分布。以分子质量的对数（lgM）为纵坐标，各标准品保留时间（t）为横坐标，得到标准曲线lgM=-0.209t＋6.992，决定系数R2为0.991 3，根据回归方程计算出样品分子质量在各范围的分布情况，将主要分子质量分布分为3 个部分：大于1 000、1 000～500 Da和小于500 Da。由表4、图3可知，SFBPH分子质量更小，小于1 000 Da的小分子占73.78%，其中小于500 Da的占35.59%，HFBPH中分子质量小于500 Da的占29%，说明经汽爆预处理的鱼骨蛋白酶解更彻底。

表4 2 种鱼骨蛋白酶解液分子质量分布情况Table 4 Relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

图3 酶解产物分子质量分布色谱图Fig. 3 Chromatograms showing the relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

3 结 论

研究汽爆和热处理2 种不同预处理方式对鱼骨蛋白酶解液游离氨基酸和挥发性成分的影响。结果表明，经胰蛋白酶酶解3 h后，SFBPH的水解度为24.85%，高于HFBPH（20.59%），2 种酶解液中分子质量分布小于1 000 Da的小分子分别占73.78%和66.56%。SFBPH中游离氨基酸总量达到28.36 mg/mL，是HFBPH的1.3 倍，SFBPH中TAV最大的为赖氨酸，HFBPH中TVA最大的为甲硫氨酸。SFBPH和HFBPH中呈苦味氨基酸分别占总氨基酸的64.88%和64.23%，可见2 种酶解液整体滋味以苦味为主，如何脱苦是需要解亟待解决的问题。固相微萃取-气相色谱-质谱共鉴定出77 种挥发性风味化合物，SFBPH中共检测出61 种挥发性化合物，HFBPH中检测出47 种，其中烃类和醛类物质最丰富。SFBPH中酮类、醛类、烃类和杂环类物质相对含量高于HFBPH，而在HFBPH中杂环类种类较多，酸类和酯类物质相对含量高于SFBPH。