七氟醚后处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用研究①

李泳洁，马海平，吴建江，杨 龙，郭 海，王 江

（新疆医科大学第一附属医院麻醉科，乌鲁木齐830054）

心肌缺血/再灌注损伤（Ischemia/reperfusion injure,I/RI）是临床常见的病理生理过程，也是患者围术期心脏不良事件发生和死亡的重要原因[1]。七氟醚后处理（Sevoflurane postconditionning,SPostC）已被证实可通过抑制细胞凋亡、减少活性氧（ROS）的生成、增加腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的含量和减少乳酸脱氢酶（LDH）含量，对心肌所发生的I/RI发挥良好的心肌保护作用，是极具希望的抗心肌损伤的治疗手段[2]，但其具体作用机制尚不明确。前期研究表明，缺 氧 诱 导 因 子-1α（Hypoxia-inducible factors-1α,HIF-1α）作为调控心肌低氧坏境下启动内源性保护机制的始动因子，是介导SPostC发挥心脏保护作用的关键靶点[3-4]。Jankauskas等[5]研究报道，巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF）作为HIF-1α的下游因子，在心肌I/RI过程中同样发挥重要的作用。在心肌组织中HIF-1α和MIF的表达水平有密切的相关性，MIF的表达随着HIF-1α表达上调而增加[6]。但是HIF-1α/MIF信号轴在SPostC减轻心肌I/RI中发挥的具体作用尚不清楚。本研究通过建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，探讨HIF-1α/MIF信号轴在SPostC对抗心肌细胞H/R损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 大鼠心肌细胞（H9C2）细胞株（武汉普诺赛，中国）；缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体（Abcam，美国），巨噬细胞移动抑制因子（MIF）抗体（Abcam，美国），腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）抗体（CST，美国），磷酸化AMPKα（p-AMPKα）抗体（CST，美国），山羊抗兔IgG（Abcam，美国），山羊抗小鼠IgG（Abcam，美国），β-Actin（义翘神州，中国）；HIF-1α抑制剂YC-1（Selleck，美国）；三磷酸腺苷（ATP）试剂盒（南京建成，中国），乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成，中国），活性氧（ROS）试剂盒（南京建成，中国）；细胞培养箱MIC1-101（Billupsrothenberg，美国）

1.2 细胞培养和分组 将心肌细胞H9C2分为对照组（NOR组）、缺氧/复氧组（H/R组）、七氟醚后处理组（SPostC组）、HIF-1α抑制剂组（YC-1组）。NOR组：CO2培养箱正常培养54 h，不做任何干预。H/R组：CO2培养箱正常培养48 h后，将细胞置入三气培养箱缺氧3 h/复氧3 h。SPostC组：CO2培养箱正常培养48 h后，将细胞置入三气培养箱缺氧3 h。复氧开始前七氟醚后处理15 min，随后在CO2培养箱下继续培养165 min。YC-1组：CO2培养箱正常培养24 h后，更换含10μmol/L YC-1的培养基继续培养24 h。干预完成后将细胞置入培养箱缺氧3 h。复氧开始前七氟醚后处理15 min，随后在CO2培养箱下继续培养165 min。缺氧/复氧处理方法如下：细胞在CO2培养箱中培养24 h后换液，细胞长至80%后，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗2遍，加入不含血清不含葡萄糖的改良杜氏伊格尔培养基（DMEM），再置入37℃、94%N2、5%CO2、1%O2三气培养箱中培养3 h，即为缺氧处理；缺氧处理后弃去培养基，加入正常新鲜DMEM培养基，置入CO2培养箱中继续培养3 h，即为复氧处理。处理完毕后检测下述指标，每项检测每组细胞设置3个复孔。

1.3 七氟醚后处理干预细胞 细胞在复氧开始前实施SPostC 15 min。具体步骤：使用七氟醚挥发罐，将挥发罐出气口与便携式培养箱进气端紧密连接，调节流量2 L/min，七氟醚浓度2.4%，持续10 min后，封闭进气端与出气端。待处理细胞在充满七氟醚的三气培养箱内37℃培养15 min后取出，并在CO2培养箱下继续培养165 min。

1.4 LDH、ROS、ATP水平和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）活性检测 分别收集NOR组、H/R组、SPostC组、YC-1组的细胞和上清培养液，检测各组上清培养液中LDH含量以及细胞ROS、ATP和CCK-8活性，步骤均完全按照试剂盒和仪器说明书进行。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取NOR组、H/R组、SPostC组、YC-1组细胞，用PBS缓冲液将细胞配成106个/mL的细胞悬浮液，取1 mL细胞悬液1 000 g离心10 min，将细胞重悬于500μL的Binding Buffer中，然后依次添加Annexin V-FITC和PI溶液各5μL，完全混合后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平。所有操作按仪器和试剂说明书进行。

1.6 Western blot检测HIF-1α、MIF、AMPKα和p-AMPKα蛋白水平 采用Western blot检测NOR组、H/R组、SPostC组、YC-1组细胞中HIF-1α、MIF、AMPKα和p-AMPKα的蛋白表达水平。步骤如下：蛋白提取试剂提取各组细胞总蛋白，在样品蛋白中添加上样缓冲液，100℃煮沸5 min，取30μg样品蛋白上样电泳。将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪成合适大小，电压100 V，90 min电转至PVDF膜后，于封闭液室温封闭转印膜1 h；加入一抗（1:1 000），4℃孵育过夜；再于二抗（1:1 000）中室温孵育1 h。以β-actin为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 4组细胞活性检测结果比较 与NOR组相比，H/R组的细胞增殖百分比显著降低；与H/R组相比，SPostC组的细胞增殖百分比明显增加；与SPostC组相比，YC-1组的细胞增殖百分比显著降低，经比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。与NOR组相比，H/R组的血清LDH含量显著降低（P＜0.05）；与H/R组相比，SPostC组的血清LDH含量明显增加（P＜0.05）；与SPostC组相比，YC-1组的血清LDH含量显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 4组细胞活性检测结果比较（±s，n=5）

表1 4组细胞活性检测结果比较（±s，n=5）

注：与NOR组相比，*P＜0.05；与H/R组相比，#P＜0.05；与SPostC组相比，△P＜0.05。

指标CCK-8/%LDH/U/L NOR组100.04±6.22 113.821±18.47 H/R组83.00±4.98*201.63±28.90*SPostC组92.61±7.58*#129.54±14.20*#YC-1组81.78±4.98*#△254.20±52.45*#△F值10.18 12.39 P值0.000 0.002

2.2 4组细胞凋亡指数检测结果比较 NOR组、H/R组、SPostC组、YC-1组的心肌细胞凋亡指数分别为3.967±1.069、21.667±0.351、12.033±0.833、19.333±0.322。与NOR组相比，H/R组的细胞凋亡指数显著增加；与H/R组相比，SPostC组的细胞凋亡指数明显降低；与SPostC组相比，YC-1组的细胞凋亡指数显著增加，经比较差异均具有统计学意义（F=371.2，P=0.000）。见图1。

图1 流式细胞仪检测结果图

2.3 4 组细胞ROS生成和ATP含量测定比较 含量测定结果显示，H/R组的ROS生成高于NOR组；而SPostC组显著降低了ROS生成；HIF-1α抑制剂YC-1组促进了ROS生成（P＜0.05）。ATP含量检测显示，H/R组细胞ATP含量明显降低于NON组；而SPostC组的ATP含量比H/R组显著增加；与SPostC组相比，YC-1组ATP含量略有降低（P＜0.05）。见表2。

2.4 Western blot检测 在心肌细胞H/R模型中，HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表达呈正相关。与NOR组相比，H/R组的HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表达水平均呈低表达（P＜0.05）；与H/R组相比，SPostC组HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表达水平均呈高表达（P＜0.05）；与SPostC组相比，YC-1组的HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表达水平均呈低表达（P＜0.05）（见表3和图2）。AMPKα的蛋白表达无明显的变化趋势。

表2 4组细胞ROS生成和ATP含量测定结果比较（±s，n=3）

表2 4组细胞ROS生成和ATP含量测定结果比较（±s，n=3）

注：与NOR组相比，*P＜0.05；与H/R组相比，#P＜0.05；与SPostC组相比，△P＜0.05。

指标ATP浓度/（μmol/gprot）ROS荧光含量NOR组309.524±66.894 440.667±73.037 H/R组75.978±12.258*1 605.333±118.001*SPostC组199.969±31.854*#836.333±99.500*#YC-1组120.897±19.558*#△1 372.667±100.610*#△F值22.99 84.39 P值0.000 0.000

表3 4组细胞HIF-1α、MIF、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达水平比较（±s，n=3）

表3 4组细胞HIF-1α、MIF、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达水平比较（±s，n=3）

注：与NOR组相比，*P＜0.05；与H/R组相比，#P＜0.05；与SPostC组相比，△P＜0.05。

组别NOR组H/R组SPostC组YC-1组F值P值HIF-1α 0.569±0.007 0.888±0.038*1.191±0.043*#0.889±0.089*#△66.31 0.000 MIF 0.251±0.013 0.393±0.045*0.622±0.138*#0.426±0.071*#△12.85 0.000 AMPKα 0.551±0.016 0.545±0.033 0.529±0.063 0.575±0.062 14.67 0.000 p-AMPKα 0.311±0.078 0.405±0.062*0.668±0.130*#0.395±0.057*#△10.19 0.000

图2 蛋白表达水平条带图

3 讨论

本研究采用H9C2心肌细胞，建立心肌细胞H/R模型。参考Yu等[7]的前期研究及预实验结果，本研究选择2.4%七氟醚和缺氧3 h/复氧3 h进行模型建立，结果显示心肌细胞H/R后细胞活性显著降低，细胞凋亡明显增加，提示心肌细胞H/R损伤模型建立成功。

本研究H/R组中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表达明显降低，ATP生成减少，细胞凋亡和ROS、LDH含量显著增加，但SPostC组的HIF-1α表达上调，细胞凋亡率的降低，LDH和ROS的含量减少，表明SPostC明显改善心肌细胞H/R损伤，同时细胞活性和ATP生成也显著增加，比H/R组较好地维持了心肌细胞的完整性，减少了细胞损伤。研究结果表明心肌细胞H/R损伤后，HIF-1α表达水平显著减少，而SPostC能显著激活HIF-1α的表达，增加细胞活性，表明HIF-1α在SPostC对抗心肌细胞H/R损伤过程中的重要作用,再次验证了HIF-1α作为SPostC介导心肌保护作用的关键靶标。

有研究表明，HIF-1α作为心肌内源性保护机制的关键靶标，缺氧情况下HIF-1α表达增加不但可调节线粒体呼吸链能量生成，还能够减少线粒体来源的ROS，从而避免心肌细胞损伤[8]。也有研究发现，HIF-1α表达增加可以激活VEGF表达促血管生成信号，进一步减少心肌梗死面积[9]。虽然以上研究都表明HIF-1α表达的增加能够减轻心肌I/RI，但并未阐明HIF-1α发挥心肌保护作用的分子机制。

巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种多效炎症细胞因子，由包括心肌细胞在内的免疫细胞和非免疫细胞产生[10]，在炎症反应和免疫调节中发挥重要作用[11]。充足的证据表明，MIF参与了病理条件下的心功能调节，包括烧伤、糖尿病和缺血/再灌注损伤[12-13]。也有研究证实MIF在缺血预处理发挥心肌保护中发挥着至关重要的作用[14]，缺血预处理通过介导MIF激活再灌注损伤救援激酶（RISK）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路，减少了心肌梗死面积和心肌细胞凋亡[15]、抑制ROS生成[16]和细胞的炎性浸润，维持了内皮细胞功能[17]，从而改善了心肌I/RI导致的心功能不全[18]。也有研究表明MIF通过抑制c-Jun N末端激酶（JNK）介导的细胞凋亡[19]，并通过其抗氧化能力为心肌I/RI时提供心肌保护作用。本研究重点关注SPostC对抗心肌细胞H/R损伤时HIF-1α对MIF的影响，发现HIF-1α表达增加后显著上调MIF的表达，两者呈正相关。因此认为，MIF作为SPostC发挥心肌保护作用的关键。

研究通过对各组细胞Western blot检测，H/R组中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表达均呈低表达；SPostC组中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表达均呈高表达；但是在YC-1组HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表达均呈低表达。本研究在证实了SPostC通过介导HIF-1α发挥心肌保护作用的基础上，进一步证明了SPostC是通过上调HIF-1α/MIF信号轴发挥心肌保护作用。为进一步验证HIF-1α/MIF信号轴是介导SPostC减轻心肌细胞H/R损伤的重要靶标，本研究使用了HIF-1α抑制剂YC-1，发现HIF-1α被抑制后，SPostC的保护作用消失，同时伴有MIF和p-AMPKα的表达水平下降。这说明在心肌细胞H/R损伤时，SPostC发挥作用是通过调控HIF-1α/MIF信号轴降低细胞凋亡，减少LDH和ROS含量，促进ATP生成，减轻缺氧心肌细胞损伤。因此认为，HIF-1α/MIF信号轴是作为SPostC发挥保护作用的关键靶标。

综上所述，上调HIF-1α/MIF信号轴的表达可能是SPostC发挥保护作用的内在机制，HIF-1α/MIF信号轴是SPostC对抗心肌细胞H/R损伤的关键靶标，在SPostC介导的心肌保护作用中发挥着重要作用。但本研究只限于细胞水平，下一步还需通过离体和在体动物实验验证HIF-1α/MIF信号轴在SPostC中的作用。