NSC74859对食管鳞状细胞癌人源肿瘤异种移植模型的抗肿瘤作用研究①

张琪琪，刘 清，郑树涛，刘 涛，杨丽菲，韩秀娟，卢晓梅

（1新疆医科大学临床医学研究院，2省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，乌鲁木齐830011；3新疆医科大学第一附属医院检验科，乌鲁木齐830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）是最常见的上消化道恶性肿瘤之一，男性多于女性，其发病年龄多在40岁以上。报道显示全球食管癌发病率和死亡率分别位列第7位和第6位。国际癌症研究机构（IARC）报道2018年有57.2万人新诊断为食管癌，同时有50.9万人死于食管癌，据WHO数据，中国食管癌患病率和死亡率排在全球第五位[1]。食管癌的主要组织学类型包括食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）、食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在我国，食管癌以鳞状细胞癌为主，其术后5年生存率仅为5%～20%[2]，患者就诊时常常已是晚期，是导致食管癌死亡率居高不下的重要原因。食管癌的临床治疗方法包括手术治疗、放疗、化疗、内窥镜治疗、中药抗肿瘤治疗、姑息治疗等。虽然这些传统的治疗方法已在临床应用多年，但食管癌患者的预后仍较差[3-4]。因此，寻找新的食管癌诊断及治疗靶点，从而提高食管癌的早诊早治非常重要。

信号转导和转录激活因子3（STAT3）是具有转录活性的癌基因，广泛参与各项细胞生理及病理学过程，包括恶性肿瘤的发生、侵袭转移、免疫调节等[5]。已有研究发现，STAT3在食管癌患者中阳性率较高，与肿瘤分化程度、TNM分期有一定的关系，STAT3阳性表达患者的中位生存时间明显缩短，可作为判断患者预后的潜在因子[6-7]。STAT3被激活后可以产生免疫抑制作用，抑制STAT3的过度表达不仅能阻断肿瘤细胞的过度增殖，还可以增强机体对肿瘤的免疫能力。近年来，STAT3靶向抑制剂WP1066、S3I-201（NSC 74859）在减缓肿瘤进展和增强化疗药物敏感性中的作用取得初步进展，但其机制有待进一步探索。因此，本研究旨在通过构建ESCC人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDX），观察STAT3小分子抑制剂NSC74859的抗肿瘤作用，并进一步研究其抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 NSC74859，Cat.#：HY-15146/CS-0512，CAS：501919-59-1，批号Lot#：10830，分子量：365.36，厂家：MCE。Corn oil（溶媒），Cat.#：HYY1888/CS-0040437，CAS：8001-30-7，批 号Lot#：56297，厂家：MCE。BCA蛋白定量试剂盒购自Solarbio公司。STAT3、p-STAT3抗体购自Cell Signaling Technology公司。免疫组织化学（EnVision两步法）试剂盒、DAB显色剂购自于北京中杉金桥生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 利用UALCAN分析STAT3在肿瘤及正常样本中的表达UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一个全面的、交互式的癌症组学数据分析网络资源。它建立在PERL-CGI上，使用javascript和CSS提供高质量的图形。UALCAN包含TCGA、MET500和CPTAC癌症组学数据。

1.2.2 实验动物 BALB/c nude小鼠，雌性，9～10周（肿瘤组织接种时的小鼠周龄），体重16.8～20.7 g。购自北京安凯毅博生物技术有限公司，动物合格证编号：1103301911000940。饲养环境：SPF级。

1.2.3 实验动物饲养室的环境条件 实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度21.5～23.2℃，湿度48%～62%，10～20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12 h/12 h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水（高压蒸汽灭菌后使用），饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325 mm×210 mm×180 mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物，笼卡上标明实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳号进行标记。

1.2.4 ESCCPDX动物模型的建立 经过医院伦理委员会审批（审批号:20160218-123），从医院获得2例新鲜患者ESCC肿瘤组织，命名为ES0172模型和ES0195模型。将肿瘤组织切成直径为2～3 mm的瘤块，并在生物安全柜中接种于BALB/c nude小鼠右前肩胛处皮下（F0代）。在小鼠体内进行传代移植3次（F1-F3代）。

1.2.5 动物分组及给药及肿瘤体积测量及实验观察第F4代时，当肿瘤平均体积达到150 mm3左右时，根据肿瘤大小将小鼠随机分为两组，NSC74859治疗组及溶媒对照组，每组5只PDX小鼠。NSC74859治疗组予以NSC74859 5 mg/kg腹腔注射，每天1次，连续注射7 d，溶媒对照物组予以等体积溶媒注射，每天1次，连续注射7 d。肿瘤接种后，常规监测包括肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。每周称量每组实验小鼠体重2次，每周2次使用游标卡尺测量皮下肿瘤组织的最长径（a）与最短径（b），计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。给药28 d后实验动物脱颈椎处死，摘取肿瘤组织，并称量肿瘤湿重。肿瘤体积计算公式如下：肿瘤体积（mm3）=（a×b2）×0.5。结果 判断标准：相对肿瘤抑制率TGI（%）：TGI=1-T/C（%）。T/C%为相对肿瘤增殖率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积（RTV）。计算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%（TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：对照组平均RTV；RTV=Vt-V0，V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积）。

1.2.6 Western blot分析 用RIPA裂解液（包含1%的蛋白酶抑制剂）提取肿瘤组织的总蛋白，然后用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。用10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白，然后转印迹到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封膜2 h后，用一抗在4℃下于摇床上缓慢孵育过夜。次日洗膜后用二抗在室温下于摇床上缓慢孵育2 h。洗膜后用Novex®AP显色底物（BCIP/NBT）显色，观察蛋白条带。使用ImageJ软件（1.8.0,USA）对蛋白条带进行半定量分析。STAT3浓度稀释比为1:1 000，p-STAT3Y705浓度稀释比为1:2 000。

1.2.7 免疫组织化学染色分析 对石蜡包埋的肿瘤组织进行苏木精伊红（HE）染色和免疫组织化学染色（IHC）。组织样品经脱蜡后在梯度酒精里进行水化，然后用3%H2O2去除内源性过氧化物酶对染色的影响。经柠檬酸缓冲液处理后用山羊血清在室温下封闭30 min。然后与一抗在4℃下孵育过夜。次日用二抗（酶偶联山羊抗兔或抗鼠）在37℃下孵育60 min。最后用DAB显色液进行显色，用苏木素进行复染。p-STAT3Y705浓度稀释比为1:200。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行处理。若数据符合正态分布，计量资料以（±s）表示，用t检验进行两组之间单因素分析。非正态分布计量资料采用Mann-Whitney U秩和检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT3在肿瘤及正常样本中的表达 利用UALCAN癌症组学数据分析网络资源分析了STAT3在肿瘤及正常样本中的表达。由分析结果可知，STAT3在多个肿瘤中高表达，如宫颈癌（CESC）、胆管癌（CHOL）、食管癌（ESCA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、胃癌（SATD）等，但在肺鳞状细胞癌（LUSC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、结肠腺癌（COAD）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）等低表达（图1）。其中，STAT3在ESCA中的表达最高，平均值为6.82（图2）。

图1 STAT3在肿瘤及正常样本中的表达

图2 STAT3在肿瘤中的表达

2.2 ESCC PDX模型临床背景信息 ES0172模型和ES0195模型均为食管鳞状细胞癌。ES0172模型的患者为男性，62岁，临床分期：T2N1M0,IIB，肿瘤分级：II-III，分型：髓质型；ES0195模型的患者为女性，58岁，临床分期：T3N0M0，IIA，肿瘤分级：II-III，分型：溃疡型。

2.3 NSC74859对ESCC PDX模型小鼠肿瘤生长的抑制作用 ES0172模型在给药开始后第21天起NSC74859治疗组与溶媒对照组在肿瘤体积上出现统计学差异，ES0195模型在给药开始后第16天起NSC74859治疗组与溶媒对照组在肿瘤体积上出现统计学差异。ES0172模型在给药开始后第28天时，溶媒对照组小鼠平均肿瘤体积为1 032.68 mm3，相对肿瘤体积（RTV）为889.99 mm3；NSC74859治疗组小鼠平均肿瘤体积为586.91 mm3，相对肿瘤体积（RTV）为445.38 mm3；相对肿瘤抑制率TGI（%）为49.96%，与溶媒对照组相比差异有统计学意义（P=0.020）。ES0195模型在给药开始后第26天时，溶媒对照组小鼠平均肿瘤体积为660.43 mm3，相对肿瘤体积（RTV）为517.32 mm3；NSC74859治疗组小鼠平均肿瘤体积为382.27 mm3，相对肿瘤体积（RTV）为238.58 mm3；相对肿瘤抑制率TGI（%）为53.88%，与溶媒对照组相比差异有统计学意义（P=0.010）（表1、2）。在ES0172模型中，NSC74859治疗组小鼠平均肿瘤重量为484.22 mg，溶媒对照组小鼠平均肿瘤重量为855.80 mg，治疗组与对照组相比下降了约43.42%，差异有统计学意义（P=0.041）；在ES0195模型中，NSC74859治疗组小鼠平均肿瘤重量为228.90 mg，溶媒对照组小鼠平均肿瘤重量为533.74 mg，治疗组与对照组相比下降了约57.11%，差异有统计学意义（P=0.044）（图3）。

表1在ES0172模型中两组肿瘤体积对比（mm3，±s）

表1在ES0172模型中两组肿瘤体积对比（mm3，±s）

注：与溶媒对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

时间给药开始后0天给药开始后4天给药开始后7天给药开始后11天给药开始后14天给药开始后18天给药开始后21天给药开始后25天给药开始后28天NSC74859治疗组141.53±9.11 170.53±10.57 251.74±23.66 253.58±32.93 336.96±45.52 421.44±71.72 438.86±84.13*535.42±92.67**586.91±108.55*溶媒对照组142.69±6.41 175.88±10.66 285.20±40.08 315.85±43.90 402.88±33.68 588.64±59.76 730.33±71.34 934.86±107.67 1032.68±113.66

2.4 p-STAT3在NSC74859治疗组和溶媒对照组中的表达 在ES0172模型和ES0195模型中，运用Western blot分析p-STAT3在NSC74859治疗组中的表达水平显著低于溶媒对照组，差异具有统计学意义（*P＜0.05，图4）。运用免疫组织化学方法检测了p-STAT3在NSC74859治疗组和溶媒对照组中的表达，p-STAT3在NSC74859治疗组呈阴性表达，在溶媒对照组中呈阳性表达（图5）。

表2在ES0195模型中两组肿瘤体积对比（mm3，±s）

表2在ES0195模型中两组肿瘤体积对比（mm3，±s）

注：与溶媒对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

时间给药开始后0天给药开始后2天给药开始后6天给药开始后9天给药开始后13天给药开始后16天给药开始后20天给药开始后22天给药开始后26天NSC74859治疗组143.69±5.43 151.06±7.02 221.09±34.56 252.61±35.39 290.14±39.32 314.29±46.69*362.90±54.16*386.98±81.46*382.27±62.12**溶媒对照组143.11±4.69 174.47±10.46 340.93±54.19 383.79±64.45 412.74±66.49 472.33±62.07 566.68±65.59 613.28±68.39 660.43±64.63

图3典型ESCC PDX小鼠及相对应的瘤体图片

图4 Western blot分析p-STAT3、STAT3在NSC74859治疗组和溶媒对照组中的表达水平

图5免疫组织化学检测p-STAT3在NSC74859治疗组和溶媒对照组中的表达（×400）

3 讨论

肿瘤的发生、发展涉及到多种信号途径，这些信号途径最终将集中于有限的转录因子。阻断一个转录因子，即可阻断调控该转录因子上游多种异常的肿瘤信号途径。STAT3是IL-6/Jak、Src、EGFR等多个致癌性酪氨酸激酶信号通路汇聚的焦点，在多种肿瘤细胞和组织中都有激活。STAT3被激活后可诱导与细胞增殖、分化、凋亡密切相关基因的异常表达，在促进肿瘤细胞增殖、分化、细胞周期进程、转移、血管生成、免疫抑制和化疗耐药等方面发挥重要作用[8]。因此，针对STAT3的靶向抑制剂有望成为治疗恶性肿瘤的重要手段之一。本研究对STAT3小分子抑制剂NSC74859的体内抗肿瘤作用及其机制进行了研究。结果表明NSC74859能减轻ESCC肿瘤负荷，其抗肿瘤机制可能与下调STAT3的磷酸化水平有关。

目前研究较多的STAT3抑制剂按类别可以分为肽类、天然产物类以及通过计算机药物虚拟筛选技术发现的小分子。NSC74859，作为STAT3的小分子抑制剂，其抗肿瘤作用已在多种肿瘤中被证实。有研究证明NSC74859通过抑制STAT3的激活，下调HIF-1α和血管内皮生长因子的表达，使食管鳞癌具有放射增敏作用[9]。人源肿瘤异种移植模型（PDX）已被开发用于将基础研究转化为临床应用[10]。通过将患者的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立的PDX模型在组织病理学、分子生物学和基因水平上保留了大部分原代肿瘤的特点，具有较好的临床疗效预测性，在临床肿瘤的精准治疗研究中发挥着不可替代的作用。目前，PDX模型已应用于多种肿瘤研究，特别是肿瘤耐药研究[11-14]。本研究构建了ES0172和ES0195两例ESCC PDX模型用于研究NSC74859的抗肿瘤效应，其结果更加贴近临床，更真实有效。但由于负荷肿瘤的小鼠均为免疫缺陷的小鼠，因而PDX模型不能用于筛选免疫相关药物如疫苗、免疫调节药物。本研究检测了PDX小鼠肿瘤组织中STAT3、p-STAT3的表达，结果显示NSC74859显著下调了STAT3的磷酸化水平，提示NSC74859抑制肿瘤的生长是通过下调STAT3的磷酸化实现的。有研究报道STAT3抑制剂NSC74859可有效延缓肛门鳞癌(ASCC)小鼠模型的肿瘤生长[15]，与本研究结果一致。

综上所述，NSC74859通过下调STAT3的磷酸化对ESCCPDX模型肿瘤的生长产生抑制作用，这不仅将更加全面的评价NSC74859的抗肿瘤药效，而且会为ESCC的药物研究评估及筛选、癌症患者的个体化治疗提供良好的模型。