食管鳞癌细胞KYSE150外泌体对细胞恶性表型的影响①

杨丽菲，郑树涛，刘 清，刘 涛，张琪琪，阿尔孜古丽·吐尔逊，卢晓梅

（1省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，2新疆医科大学附属肿瘤医院肺内科一病区，3新疆医科大学临床医学研究院，乌鲁木齐830011；4新疆医科大学第一附属医院检验科，乌鲁木齐830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）是我国常见的恶性肿瘤，根据最新发布的我国恶性肿瘤发病和死亡资料显示2015年我国食管癌的发病率和患病率分别位于第6位和第4位[1]。目前，食管癌仍是危害人群健康的主要疾病。因多数患者就诊时已处于疾病中、晚期，因而五年生存率低[2]。以往的研究[3-4]表明其发病可能与遗传、环境等因素有关，但具体的病因仍不明确，因而揭示食管癌转移的分子机制进而指导临床治疗改善患者预后尤其重要。

外泌体是由脂质双分子层包裹着核酸及蛋白质的纳米级膜性囊泡，细胞会根据所处环境不同分泌不同的外泌体[5]。研究发现多种类型的细胞如红细胞、淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等均可分泌外泌体,因此在血液、唾液、脑脊液、尿液、乳汁、腹水等多种体液中均可检测到外泌体[5]。外泌体一个非常重要的特征就是它们携带了大量的核酸物质，因而它在细胞与肿瘤微环境的物质传递和信息交流方面发挥了极其关键的作用。有研究发现肿瘤细胞分泌外泌体的量是正常细胞的十倍[6]。为进一步明确外泌体对肿瘤细胞恶性表型的影响，本研究探讨食管鳞癌细胞KYSE150外泌体对其自身细胞增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 KYSE150获赠于中国医学科学院国家重点实验室。RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Hyclone公司）、青-链霉素均购自Hyclone公司。无外泌体FBS(ZETA公司)、Matrigel（BD公司）。Transwell小室（Corning公司）。外泌体提取试剂盒购自QIAGEN公司。Exo-Glow Green绿色荧光染色试剂盒购于SBI公司。CD9、CD81抗体购于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RPMI-1640培养基培养KYSE150细胞系，培养基中加入含1%青－链霉素和10%FBS。将细胞置于37℃、5%CO2培养箱培养。当细胞长至80%～90%时消化传代。

1.2.2 外泌体的分离与纯化 KYSE150细胞在含常规10%的FBS培养基中培养一定时间，细胞融合度约为60%～70%时，移去原有含FBS的培养基，使用PBS冲洗3遍，换成新鲜的含10%的无外泌体FBS的培养基，继续培养48 h左右，细胞融合度达到80%～95%左右时，收取细胞上清100 mL用于提取外泌体。依据外泌体提取试剂盒步骤，分离富集外泌体后冻于-80℃保存。

1.2.3 外泌体鉴定 电镜鉴定：向直径为2 mm的铜网上滴加20μL外泌体。室温复染1%的醋酸铀染液室温约10 min,然后用滤纸吸干1%的醋酸铀染液室温晾干(约2 h左右)。透射电镜于120 kV下观察外泌体形态并拍照。外泌体粒径分布分析：使用一定体积的PBS重悬KYSE150细胞外泌体，待外泌体稀释至合适的浓度后，上机检测外泌体颗粒的粒径分布。蛋白免疫印迹鉴定：取KYSE150细胞外泌体,加入适量蛋白裂解液裂解后，4℃、12 000 rpm离心20 min,离心后上清成分即为外泌体蛋白。依据BCA试剂盒操作步骤测定外泌体蛋白浓度。上样量为50μg进行电泳，浓缩胶以电压70 V电泳，进入分离胶后调整电压为100 V。采用湿转的方法转膜，100 V转膜120 min，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后将膜置于CD9、CD63（均为1∶1 000）的一抗4℃摇床过夜。次日TBST洗膜3次后二抗（1∶10 000）孵育1 h。后曝光液曝光显影拍照。

1.2.4 外泌体吞噬鉴定 提前一天将KYSE150细胞接种至35 mm小皿中，每孔细胞数约2×105个，使用PKH-67绿色荧光染料按说明书标记外泌体和PBS。待细胞贴壁后加入荧光标记的外泌体（20μg/mL）和同等体积PBS，培养2 h后，在共聚焦显微镜下观察。

1.2.5 细胞划痕实验 提前一天将对数生长期KYSE150细胞接种至6孔板，每孔细胞数约1×106。待细胞贴壁后每孔用100μL枪头划3条平行线，换用无血清RPMI-1640培养细胞，同时实验组加入外泌体（20μg/mL），对照组加入等量PBS。在划痕0、24 h观察划痕面积并采集图像，用Image J软件分析细胞迁移率。

1.2.6 Transwell细胞侵袭实验 Transwell上室加入配置好的matrigel胶（matrigel胶：RPMI-1640培养基＝1∶8）60μL，37℃放置2 h。然后在transwell上室内加入100μL无血清RPMI-1640培养基，随后将小室置于5%CO2、37℃培养箱中静置30 min以软化基质膜。将100μL KYSE150细胞悬液（细胞数为5 000个/孔）加入上室，同时实验组上室加150μL无血清RPMI-1640培养基重悬的外泌体（20μg/mL），对照组小室上层加150μL无血清RPMI-1640培养基。实验组和对照组下室均加600μL含10%无外泌体FBS的RPMI-1640培养基，随后将小室置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h。第二天取出后PBS清洗两遍，将transwell小室置于4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1%结晶紫室温染色10 min，正置显微镜下随机选取约6个视野拍照，计数统计。

1.3 统计学处理 所有数据均使用Graphpad 8.0软件进行处理分析，实验数据均经正态性和方差齐性检验，以均数±标准差（±s）表示。组间采用t检验比较方差齐性，方差不齐时采用近似t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定 纳米粒子示踪分析显示微粒直径范围多为30～200 nm；电镜提示微粒为圆形囊状结构；而免疫印迹检测提示微粒表达CD9、CD81。以上结果表明KYSE150细胞上清液中提取微粒为外泌体（图1）。

2.2 KYSE150自身对外泌体的摄取 激光共聚焦微镜下观察细胞爬片，并对图片进行融合显示绿色小颗粒荧光的外泌体进入了细胞内，且外泌体位于蓝色大颗粒荧光的细胞核周围或核上（图2），提示外泌体可被KYSE150细胞吞噬。

图1 KYSE150外泌体的鉴定

图2 KYSE150外泌体被自身吞噬(×100)

2.3 KYSE150自身外泌体对细胞增殖的影响 外泌体实验组划痕24 h细胞迁移率为(64.67±3.05)%，明显高于PBS对照组细胞迁移率(47.67±2.52)%，差异有统计学意义(P=0.017)，提示食管鳞癌细胞KYSE150外泌体能增强自身肿瘤细胞增殖，见图3。

2.4 食管鳞癌KYSE150自身外泌体对细胞侵袭迁移的影响 镜下拍照可见24 h时，外泌体实验组进入到下室的细胞数量为(233.22±4.58)个，PBS对照组为(147.33±5.89)个,外泌体实验组明显高于PBS对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)，提示食管鳞癌KYSE150-外泌体能促进自身肿瘤细胞侵袭迁移，见图4。

图3 KYSE150外泌体促进自身增殖(×100)

图4 KYSE150外泌体促进自身侵袭迁移(×200)

3 讨论

肿瘤已成为仅次于心血管疾病导致人类死亡的第二大原因[7]。尽管包括放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等在内的抗肿瘤治疗取得了重大进展，但上述治疗方案在抑制肿瘤转移方面仍未获得令人满意的临床结果。目前侵袭与转移仍然是导致肿瘤患者死亡的主要原因[8]。因此，明确肿瘤转移的机制尤其重要。

外泌体是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，是细胞正常生理的一部分。外泌体的运输和转运会影响受体细胞的各种生理功能。肿瘤细胞源性外泌体通过促进肿瘤周围血管内皮细胞增殖迁移、促进肿瘤细胞免疫逃逸、以及促进肿瘤增殖进而促进肿瘤浸润转移[9]。因外泌体具有脂质双层膜，因而可以免受降解、性质稳定。外泌体有望成为早期诊断和个体化治疗的生物标记物。因此了解外泌体促进肿瘤转移机制意义重大。

在本研究中，成功提取出了食管鳞癌细胞KYSE150细胞外泌体，并通过电镜、纳米粒子示踪分析、蛋白免疫印迹法成功鉴定为外泌体。本研究检测到外泌体能被肿瘤细胞摄取和吸收，并发现外泌体对肿瘤细胞增殖、迁移有促进作用，进一步证明外泌体对肿瘤生长的促进作用，将对明确食管癌进展转移提供新的思路。

外泌体在肿瘤细胞间、肿瘤细胞与微环境物质传递和信息交流中发挥了非常重要的作用,它可以通过多种途径参与到肿瘤的发生发展过程当中。首先，外泌体是肿瘤微环境中间质细胞与肿瘤细胞沟通的桥梁，外泌体通过物质传递促进肿瘤转移。有研究发现来自间质细胞的外泌体通过转移血管生成相关microRNAs促进血管内皮细胞增殖、侵袭和迁移而促进肿瘤转移[10]。其次，肿瘤细胞源性外泌体可直接为肿瘤侵袭转移开辟道路。肝癌细胞分泌的microRNA-103能够促进肿瘤细胞转移[11]。再次，肿瘤源性外泌体通过物质传递对远隔器官微环境中的间质细胞进行改造,进而利于循环肿瘤细胞的远处定植而形成远转灶。Zhang等[12]研究发现脑部间质细胞-星形胶质细胞通过外泌体传递microRNA促进乳腺癌脑部转移瘤的生长。研究发现随着肿瘤的进展,肿瘤逐渐获得转移潜能,肿瘤分泌的外泌体内容物上皮间质转变相关蛋白增加使肿瘤逐渐获得转移潜能,还有一些帮助原位肿瘤和微环境相互作用的蛋白也增加[13]。此外，外泌体整合素在肿瘤的器官特异性转移与肿瘤细胞在远处转移部位定制起着重要的作用[14]。本研究发现外泌体可明显促进自身增殖、侵袭与迁移，与既往研究一致[15-16]。尽管已有研究发现食管鳞癌细胞通过外泌体传递miR-93-5p[17]、microRNA-21[18]等促进肿瘤侵袭与转移，根据本课题组前期比较不同病变阶段食管癌患者外周血外泌体蛋白质组学分析发现，肿瘤细胞外泌体包含上千种蛋白质，因此其促进侵袭转移机制有待深入研究。