产蛋白酶菌株P12 产酶条件的优化*

龚志立，曹 誉，刘 平，昂 学，刘 静

（湖北大学知行学院，湖北 武汉 430011）

蛋白酶是能将蛋白质水解为氨基酸或多肽的一类酶的总称，在食品、医药、制革、洗涤、化工等方面有着广泛的应用[1]，占整个酶制剂的60%以上。蛋白酶的生产可从动植物中提取，但酶得率较低，而微生物源蛋白酶因微生物生长繁殖速度快、提取工艺相对简单更为经济，因此，寻找能够高产蛋白酶的菌株对于蛋白酶的工业化生产至关重要。实验室初期从土壤中已经筛选出产蛋白酶的菌株P12，经鉴定为芽孢杆菌属。本实验对分离出的这株野生型菌株进行研究，通过调整培养条件和改良培养基配方以优化产酶条件，弥补细菌对产蛋白酶研究的不足，同时本研究对扩大微生物菌种资源的开发以及微生物蛋白酶的应用，具有一定指导意义和实际意义。

1 材料与仪器

1.1 菌株

湖北大学知行学院微生物实验室筛出的产蛋白酶芽抱杆菌P12。

1.2 主要试剂

干酪素 （分析纯），天津市凯通化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨 （均为生物试剂），上海盛思生化科技有限公司；琼脂粉 （生物试剂），上海山浦化工有限公司；尿素、硫酸铵、硝酸钾、氯化钠 （均为分析纯），天津市广成化学试剂有限公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖 （均为分析纯），上海展云化工有限公司；果糖 （生物试剂），上海展云化工有限公司。

1.3 主要仪器

7200 型可见分光光度计，上海尤尼科仪器有限公司；THZ-C 型恒温摇床，陕西鹏展科技有限公司；SW-CJ-ZD 型无菌操作台，苏州净化设备有限公司；DHP-9162 型恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.4 主要培养基

斜面培养基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉15 g/L。

基础发酵培养基：葡萄糖15 g/L，牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

2 实验方法

2.1 菌株的培养

将斜面保存菌株P12 用接种环取一环5 mg 接入种子培养基中培养，进行菌种活化，在转速为180 r/min 的摇床、温度为37 ℃的环境下培养16 h后，再以 1 mL 1%接种量接种至发酵培养基，相同条件下培养2 d 后测定蛋白酶活力。

2.2 蛋白酶酶活力测定

2.2.1 酶活单位定义

在本实验中，每1mL 粗酶液，在28℃下，10min水解酪素产生1 μg 酪氨酸即为一个酶活力单位，以U/mL 表示[2]。

2.2.2 酶活测定方法

蛋白酶活力测定采用Folin 法[3]。

2.3 单因素试验

2.3.1 碳源的选择

分别取5 份种子培养液1 mL 接入含有不同碳源的100 mL 发酵培养基中，即将基础发酵培养基中1.5 g 1.5%的葡萄糖分别替换成1.5 g 1.5%的蔗糖、麦芽糖、乳糖和果糖，在温度为37℃、转速为180 r/min 的摇床培养48 h。离心取上清得粗酶液，测定酶活力，确定最佳碳源[4]。

基于堆叠自编码网络的风电机组发电机状态监测与故障诊断//赵洪山,刘辉海,刘宏杨,林酉阔//(11):102

2.3.2 氮源的选择

分别取4 份种子培养液1 mL 接入含有最佳碳源和不同氮源的100 mL 发酵培养基中，即将基础发酵培养基中1 g 1%的蛋白胨分别替换成1 g 1%的尿素、(NH4)2SO4和KNO3，在温度为37℃、转速为180 r/min 的摇床培养48 h。离心取上清得粗酶液，测定酶活力，确定最佳氮源[5]，最佳氮源为蛋白胨。

2.3.3 不同金属离子对产酶的影响

将3 份1 mL 种子培养液分别接入含有优化碳源、氮源的100 mL 发酵培养基中，并在发酵培养基中添分别添加50 mg 0.05%的MgSO4、0.05%的CaCl2和0.05%的FeSO4，在温度为37℃、转速为180 r/min 的摇床培养48 h。离心取上清得粗酶液，测定酶活力，根据结果确定最适添加的金属离子。

2.3.4 初始pH 值的确定

取5 份1 mL 种子培养液分别接入含优化碳源、氮源和金属离子的100 mL 发酵培养基中，调节培养基pH 值分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在温度为37℃、转速为180 r/min 的摇床培养48 h。离心取上清得粗酶液，测定酶活力，确定最佳发酵初始pH 值。

2.3.5 发酵温度的确定

取5 份1 mL 种子培养液分别接入含优化碳源、氮源和金属离子的100 mL 发酵培养基中，调节发酵培养基pH 值为7.0，设定培养温度分别为28 ℃，33 ℃，37 ℃，42 ℃和 47 ℃，在转速为 180 r/min 的摇床中培养48 h。离心取上清得粗酶液，测定酶活力，确定最佳发酵温度。

2.4 正交试验设计

以碳源、氮源、初始pH 值和发酵温度作为4 个影响因素，进行正交试验，优化发酵条件，见表1。

3 结果与分析

3.1 不同碳源对菌株产酶的影响

选择葡萄糖作为碳源时的酶活力最高，达到190 U/mL，蔗糖次之，而麦芽糖、乳糖和果糖作为碳源的酶活力较低，因此菌株P12 的最适碳源为葡萄糖。

表1 4 因素3 水平表

3.2 不同氮源对菌株产酶的影响

选择蛋白胨作为氮源时的酶活力最高，达到201 U/mL，尿素、(NH4)2SO4和KNO3作为氮源的酶活力较低，因此菌株P12 的最适氮源为蛋白胨。

3.3 不同金属离子对菌株产酶的影响

在培养基中加入MgSO4时的酶活力最高，达到207 U/mL，CaCl2和FeSO4的添加几乎不影响菌株产酶能力。

3.4 不同初始pH 值对菌株产酶的影响

经比较得出培养基的初始pH 值为7.0 的酶活力最高，达到210 U/mL。

3.5 不同发酵温度对菌株产酶的影响

经比较得出发酵温度为37 ℃的酶活力最高，达到216 U/mL。

3.6 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

表2 中，极差R 表示试验因素中对酶活力的影响大小，在4 个因素中，对产酶活性影响最大的是蛋白胨，其次为葡萄糖＞发酵温度＞初始pH 值。由表2 分析得出，在A 因素葡萄糖添加量中，k 表示水平对应所有评分的平均值，例如k1表示第1 水平对应所有评分的平均值，k3最大，表示A 因素中第3水平最优，依次类推，发酵条件的最优组合为A3B3C3D1，但该组合并未在正交试验中出现。以A3B3C3D1 的组合进一步验证，酶活力达到289 U/mL，高于A3B3C2D1 的组合，从而确定发酵条件的最优组合为A3B3C3D1，即在2%的葡萄糖，1.2%的蛋白胨，初始pH 值为7.5，发酵温度为35℃的条件下，发酵液酶活力最高。

4 结论

为了研究产蛋白酶菌株P12 的产酶影响因素，本实验首先通过对菌株生长需要的营养环境 （碳源、氮源）、温度、初始pH 值等方面对产酶的影响进行单因素分析，并在此基础上做正交试验。最终得出，该菌株发酵温度为35 ℃，初始pH 值为7.5，2%的葡萄糖、1.2%的蛋白胨、0.3%的牛肉膏、0.5%的NaCl、0.05%的MgSO4的组合培养基为最优组合，发酵液酶活力达到289 U/mL。