miR-27a-3p抑制β-1，4-半乳糖基转移酶Ⅲ表达对胃癌SGC-7901细胞的影响

曹建平，佘 兰，赵娟霞

0 引 言

胃癌在中国是死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]。目前，分子靶向及免疫治疗已成为当前晚期胃癌治疗的主要方式。针对HER2、VEGF、EGFR、c-Met等分子靶向药物已取得一定疗效，但效果仍然有限[3]。故深入了解胃癌增殖和迁移的分子机制，对于寻找胃癌新的生物标志物及其潜在治疗靶点具有重要意义。

β-1，4-半乳糖基转移酶Ⅲ(β-1,4-galactosyltransferase III,B4GALT3)属于β-1，4-半乳糖基转移酶家族(B4GALT)，此家族因有不同的受体倾向分布于人体不同组织[4]，参与细胞增殖、分化、迁移、侵袭和免疫反应[5]，与恶性肿瘤的发生和进展有关[6]，但在胃癌中的生物学功能知之甚少。microRNAs(miRNAs)是一类调节RNA分子，通过靶向3′UTR中mRNAs的互补序列，导致翻译抑制或降解，调控细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、血管生成和转移[7]，在胃癌中有助于阐明肿瘤发生的分子机制，并有望成为胃癌检测的肿瘤标志物[8-10]。目前关于胃癌中miR-27a-3p靶向调控4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)表达的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨miRNAs与B4GALT3的关系，寻找能调控B4GALT3的miRNAs，分析miRNAs和B4GALT3对胃癌发生发展的作用及机制，为胃癌的诊断与治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料人正常胃黏膜腺上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901和人肾上皮293T 细胞均由南华大学肿瘤研究所保存。胃癌细胞MGC-803、BGC-823细胞由西北大学生命科学学院功能糖组学实验中心馈赠。miR-27a-3p mimic、mimic NC、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC 均为中国广州市锐博生物科技有限公司产品。

1.2生物信息学分析通过miRwalk(链接：http://www.μmm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)、miRanda(链接：http://www.microrna.org/microrna/)和TargetScan(版本6.2，http://www.targetscan.org/)在线软件进行预测和分析B4GALT3的靶标miRNAs及其结合位点。

1.3荧光素酶报告基因载体的构建和双荧光素酶报告基因根据生物信息学分析预测miR-27a-3p与B4GALT3-3' UTR的2个结合位点设计引物，在结合位点的基础上进行突变，扩增出miR-27a-3p与B4GALT3-3' UTR结合位点前后所需要的序列，插入荧光素酶报告载体，获得重组野生型载体h-B4GALT3-3UTR-WT和突变型h-B4GALT3-3UTR-MUT。将构建好质粒分别和miRNA mimic、mimic NC共转染293T细胞， 用Promega公司的双荧光素酶报告基因试剂盒测定荧光素酶活性。

1.4总蛋白的提取和Westernblot取转染了miR-27a-3p mimic、mimic NC、control(空白对照)、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC的细胞，裂解提取总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度，配平为等质量等体积的蛋白样品。上样，用SDS-PAGE胶分离，转至PVDF膜，封闭液封闭15 min，一抗B4GALT3(1∶500)4 ℃孵育过夜，洗膜3次，相应二抗在室温下摇床孵育1.5 h，洗膜3次，显影剂显影。以β-actin为内参，用Image J软件分析各组灰度值。实验重复3次。

1.5MTT实验将各转染后的细胞接种于96孔板中，每组设4个复孔。分别于转染24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后每个孔避光加入MTT溶液20 μL，孵育4 h后，于570 nm或490 nm波长处测定光吸收值(A值)，记录结果，绘制生长曲线。

1.6细胞迁移将细胞接种于6孔板中，分别按照MTT实验分组进行细胞瞬时转染。48 h后，将细胞消化后在含Transwell小室的上室加100 μL的细胞悬液，Transwell小室下室中加500 μL含10%胎牛血清的1640培养基。37 ℃含5% CO2的恒湿培养箱培养18 h后取出Transwell小室，拭去Transwell小室上表面的细胞后，4%多聚甲醛固定，37 ℃下静置18 min，固定后倒置、干燥，再加入结晶紫染色。然后在光学显微镜下观察下室内的细胞，随机取6个视野拍照，计数。

1.7侵袭实验将Matrigel均匀地平铺在Transwell嵌入物的微膜(8 μm)上，以制备凝胶，用1640培养液冲洗凝胶备用，按迁移实验细胞分组分别配置细胞悬液，接种于Transwell小室上室，后面实验步骤同迁移实验。

2 结 果

2.1Western blot检测B4GALT3在胃癌细胞系中表达与正常胃黏膜GES-1细胞相比，B4GALT3在胃癌各个细胞系中表达显著上调(P<0.05)。见图1。

2.2双荧光素酶报告基因实验验证miR-27a-3p与B4GALT3的关系生物信息学预测 miR-27a-3p的种子区与B4GALT3 3' UTR两个结合位点，根据其结合位点构建突变体及野生型载体。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-27b-3p能使野生型B4GALT3的荧光素酶的活性显著性降低(P<0.001)，说明miR-27a-3p与B4GALT3存在靶向关系。见图2。

1:SGC-7901细胞; 2:MGC-803细胞; 3:GES-1细胞; 4:BGC-823细胞

*P<0.001

2.3miR-27a-3p对B4GALT3蛋白表达水平的影响Western blot检测结果显示，瞬转miR-27a-3p mimic后，B4GALT3蛋白水平下降(P<0.01)；瞬转miR-27a-3p inhibitor后，B4GALT3表达升高(P<0.01)，说明miR-27a-3p对B4GALT3有负性调控作用。见图3。

1:空白对照; 2:mimic NC; 3:miR-27a-3p mimic; 4:空白对照; 5:Inhibitor NC; 6:miR-27a-3p inhibitor

2.4miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞的增殖影响各个时间点，与mimic NC、空白对照比较，miR-27a-3p mimic细胞增殖显著升高(P<0.05)；与inhibitor NC、control比较，miR-27a-3p inhibitor的细胞增殖显著降低(P<0.05)。见表1。

2.5miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞的迁移影响miR-27a-3p mimic迁移细胞数量较mimic NC明显增加，迁移能力显著增强(P<0.000)；miR-27a-3p inhibitor迁移细胞数量较inhibitor NC明显减少，迁移能力明显降低(P<0.000)。见图4，表2。

2.6miR-27a-3p能增强胃癌SGC-7901细胞的侵袭能力miR-27a-3p mimic较mimic NC侵袭细胞数量明显增加，侵袭能力显著增强(P<0.000)；miR-27a-3p inhibitor侵袭细胞数量较inhibitor NC明显减少，侵袭能力明显降低(P<0.000)。见图5，表2。

表 1 瞬转miR-27a-3pmimic与miR-27a-3p inhibitor后SGC-7901细胞活性变化

a:转染miR-27a-3p mimic; b:转染mimic NC; c:空白对照; d:转染Inhibitor NC; e:转染miR-27a-3pinhibitor

a:转染miR-27a-3p mimic; b:转染mimic NC; c:空白对照; d:转染Inhibitor NC; e:转染miR-27a-3pinhibitor

表 2 转染后胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭实验的变化个)

3 讨 论

近年来研究表明，胃癌是多种癌基因与抑癌基因相互作用失衡的结果，而miRNA被认为与胃癌的发生发展相关，本实验证实miR-27a-3p能使胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强，与文献报道miR-27a-3p在胃癌中高表达并对胃癌细胞的体外增殖和体内肿瘤生长均有明显的促进作用相一致[11]。而miRNAs通过对靶基因转录后水平的调节发挥着癌基因或肿瘤抑制基因的作用，例如，miR-27a-3p通过靶向调控其他基因而影响肿瘤的发生和进展，miR-27a-3p作用TXNIP抑制肾细胞癌的生长和转移[12]，通过FBXW7来促进宫颈癌的生长[13]，抑制BTG1基因减少结肠癌细胞增殖和凋亡[14]，靶向调控GSK3β基因通过wnt/β-catenin途径促进三阴性乳腺癌的增殖和迁移[15]，作用于HOXB 8促进非小细胞肺癌细胞增殖[16],通过表观遗传沉默GATA 6和激活VEGFA/VEGFR 2信号通路促进胰腺癌的血管生成和迁移等[17]。miR-27a-3p在胃癌中又是通过作用哪些靶基因来促进胃癌的发生的，本研究应用生物信息学分析推测B4GALT3可能是miR-27a-3p潜在的分子靶向基因。

据报道，B4GALT3在人类各类癌症中发挥不同的作用。B4GALT3的过表达促进了神经母细胞瘤细胞和宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭；在结肠癌和肝癌的作用又相反，B4GALT3过表达抑制结肠癌和肝癌的进展[18-21]。B4GALT3也有研究受多个miRNA的调控，如miR-1247-3p直接针对B4GALT 3导致β1-整合素-NF-κB信号在成纤维细胞中的激活控制肝癌肺转移[21]，还能促进乳腺癌细胞体外增殖、迁移与侵袭[22]。本实验通过Western blot实验证明了B4GALT3在胃癌细胞中高表达，但B4GALT3具体作用于胃癌的机制仍未知。

为了进一步探索B4GALT3和miR-27a-3p在胃癌中的关系，首先生物信息软件预测B4GALT3是miR-27a-3p的靶基因，双荧光素酶实验证实两者间存在结合作用； Western blot实验初步认为两者之间可能存在负性相关性；进一步体内实验通过MTT、Transwell迁移与侵袭实验发现，上调miR-27a-3p后，胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强。

综上所述，本研究结果显示miR-27a-3p具有促进胃癌SGC-7901细胞增殖活性、迁移和侵袭，且有可能是通过抑制B4GALT3的表达来实现的。